[發明專利]一種監控總RNA中線狀RNA消除的方法

有效

• 申請號: 201410606600.2
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104328185A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 周俊飛;李利利;陳利紅;高利芬;張繼;方治偉;章偉雄;盧龍;李甜甜;彭海
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別涉及一種監控總RNA中線狀RNA消除的方法。

背景技術

生物體內大部分的RNA為線性，但有少部分RNA首尾連接形成環狀，被稱為環狀RNA。近年來，環狀RNA迅速成為RNA世界研究的熱點，這是因為高通量測序技術可以被用于檢測環狀RNA，這極大地加快了對環狀RNA的發現及對環狀RNA功能的分析。

研究環狀RNA的前提是將環狀RNA從生物體內分離出來，目前還沒有直接從生物體內獲取環狀RNA的方法，只能從總RNA中去除線性RNA，間接達到富集環狀RNA的目的。通常，環狀RNA占總RNA的比例不到1％，在高通量測序檢測環狀RNA前，需要監控總RNA中線性RNA的去除程度。目前，一個環狀RNA樣本高通量測序檢測成本在10萬元以上。若有較多的線性RNA存在，則線性RNA會在高通量測序過程占用大量的測序資源，產生無效數據，造成人力、物力與財力的大量浪費。然而，目前還沒有監控總RNA中線性RNA的消除的方法，導致浪費難以避免。

發明內容

為了解決現有技術中無法有效監控總RNA中線性RNA的去除程度的問題，本發明實施例提供了一種監控總RNA中線狀RNA消除的方法。所述技術方案如下：

本發明實施例提供了一種監控總RNA中線狀RNA消除的方法，所述方法包括：

人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環狀ERCC-0013-RNA；

對所述外源環狀ERCC-0013-RNA進行質量控制；

將所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得到混合外源RNA；

向待檢樣本的總RNA中加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA的質量比為2000:1，得到第一混合物；

去除所述第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；

去除所述第二混合物中的線性RNA，所述線性RNA包括所述總RNA中的內源線性RNA和所述外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；

分別檢測所述第一混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環狀ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環狀ERCC-0013-RNA的含量；

根據所述含量計算所述總RNA中所述線性RNA的去除比例。

具體地，所述人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環狀ERCC-0013-RNA，包括：

選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；

將所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達載體中，分別獲得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；

將獲得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因分別在體外轉錄，分別合成所述外源線性ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA；

去除所述外源線性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸結構，并在所述外源線性ERCC-0013-RNA的5’端合成羥基；

對5’端為羥基的所述外源線性ERCC-0013-RNA進行磷酸化修飾，合成5’端經磷酸化修飾的所述外源線性ERCC-0013-RNA；

將所述5’端經磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端連接，合成所述外源環狀ERCC-0013-RNA；

利用RNA酶R切掉未環化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA，得到所述外源環狀ERCC-0013-RNA。

進一步地，所述待檢樣本的基因中不存在與所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源的基因。

具體地，所述對所述外源環狀ERCC-0013-RNA進行質量控制，包括：