[發明專利]一種監控總RNA中線狀RNA消除的方法

有效

• 申請號: 201410606600.2
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104328185A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 周俊飛;李利利;陳利紅;高利芬;張繼;方治偉;章偉雄;盧龍;李甜甜;彭海
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

1.一種監控總RNA中線狀RNA消除的方法，其特征在于，所述方法包括：

人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環狀ERCC-0013-RNA；

對所述外源環狀ERCC-0013-RNA進行質量控制；

將所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得到混合外源RNA；

向待檢樣本的總RNA中加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA的質量比為2000:1，得到第一混合物；

去除所述第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；

去除所述第二混合物中的線性RNA，所述線性RNA包括所述總RNA中的內源線性RNA和所述外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；

分別檢測所述第一混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環狀ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環狀ERCC-0013-RNA的含量；

根據所述含量計算所述總RNA中所述線性RNA的去除比例。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環狀ERCC-0013-RNA，包括：

選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；

將所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達載體中，分別獲得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；

將獲得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因分別在體外轉錄，分別合成所述外源線性ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA；

去除所述外源線性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸結構，并在所述外源線性ERCC-0013-RNA的5’端合成羥基；

對5’端為羥基的所述外源線性ERCC-0013-RNA進行磷酸化修飾，合成5’端經磷酸化修飾的所述外源線性ERCC-0013-RNA；

將所述5’端經磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端連接；

利用RNA酶R切掉未環化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA，得到所述外源環狀ERCC-0013-RNA。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述待檢樣本的基因中不存在與所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源的基因。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述對所述外源環狀ERCC-0013-RNA進行質量控制，包括：

利用隨機引物對合成的所述外源環狀ERCC-0013-RNA進行逆轉錄，合成外源ERCC-0013-cDNA，所述外源ERCC-0013-cDNA包括外源線性ERCC-0013-cDNA和外源環狀ERCC-0013-cDNA；

利用第一引物和第二引物分別對所述外源ERCC-0013-cDNA進行實時定量PCR擴增，所述第一引物包括如序列表中SEQ?ID?NO:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ?ID?NO:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ?ID?NO:5所示的第二正向引物和如序列表中SEQ?ID?NO:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于擴增所述外源線性ERCC-0013-cDNA和所述外源環狀ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于擴增所述外源環狀ERCC-0013-cDNA，通過所述第一引物擴增獲得CT1值，通過所述第二引物擴增獲得CT2值；

通過C_T1值和C_T2值以及公式計算合成的所述外源環狀ERCC-0013-RNA的環化比例，并選用環化比例超過90％的所述外源環狀ERCC-0013-RNA。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的線性RNA。