[發(fā)明專利]基于納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410606027.5
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104316497A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 何丹農;胡沖婭;顏娟;金彩虹
• 申請（專利權）人: 上海交通大學;上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N21/49
• 分類號: G01N21/49
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 徐紅銀;郭國中

技術領域

本發(fā)明涉及納米材料的功能化及應用領域，尤其是一種基于納米金及LSCM(激光掃描共聚焦顯微鏡)反射光模式的細胞成像方法。

背景技術

目前，已有許多研究表明納米金可以作為探針進入生物組織內部探測生物分子的生理功能，進而在分子水平上解釋生命過程。由于其良好的生物相容性和無毒副作用，被廣泛的應用在生物化學分析，生物分子標記和檢測等領域。如納米金探針在免疫分析中的應用，納米金探針在單細胞分析中的應用，納米金探針在靶向藥物中的應用，納米金探針在DNA檢測中的應用等，然而在眾多應用中，納米金的光學檢測靈敏度仍受到限制，需要結合熒光染料標記法，表面增強拉曼散射等技術來使用，對于其應用造成了局限。

LSCM(Lsaer?scanning?confocal?microscope，激光掃描共聚焦顯微鏡)是一種先進的分子生物學和細胞生物學研究儀器。它在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，結合數據化圖像處理技術，采集組織和細胞內熒光標記圖像，在亞細胞水平觀察鈣等離子水平的變化，并結合電生理等技術觀察細胞生理活動與細胞形態(tài)及運動變化的相互關系。由于它的應用范圍較廣泛，已成為形態(tài)學、分子細胞生物學、神經科學和藥理學等研究領域中很重要的研究技術。但在上述應用中，大部分都需要對目標進行熒光標記，在這過程中，熒光探針在裝載及成像過程中易發(fā)生熒光淬滅，影響實驗結果，并且實驗步驟復雜，不易操作。而納米金作為一種較為穩(wěn)定的體系，只要在其表面接上靶向分子，則能使其對細胞有特異性的靶向作用，能大量的粘附在細胞表面或進入細胞內，然后采用激光共聚焦反射光的模式來觀察納米金的反射光，可以較為便捷地實現細胞的激光掃描共聚焦顯微鏡成像。在現有的研究中，尚未見利用激光掃描共聚焦顯微鏡反射光模式觀察納米金生物探針與細胞相互作用及細胞成像的研究。

發(fā)明內容

針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現的：

本發(fā)明提供一種基于納米金及LSCM反射光模式的細胞成像方法，將特異性的靶向分子組裝到納米金顆粒表面構成探針，在LSCM下可直接觀察到該探針，將其與細胞共培養(yǎng)后，可利用LSCM觀察細胞內部及表面的納米金生物探針的數量、分布及形態(tài)。

優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟：

(1)采用檸檬酸三鈉還原制得金種溶液；

(2)采用種子生長法制得大粒徑的納米金溶液；

(3)將靶向分子加入到步驟(2)制備的納米金溶液中，混合均勻，進行組裝；

(4)組裝好的溶液離心洗滌；

(5)洗滌后得到納米金生物探針，將該探針用細胞培養(yǎng)基重懸??；

(6)將(5)處理后的納米金生物探針加入到細胞中，于培養(yǎng)箱中與細胞共培養(yǎng)；

(7)將細胞用緩沖液洗滌并用多聚甲醛固定后，即可在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察成像。

優(yōu)選地，所述納米金溶液所用納米金的粒徑為40-50nm；粒徑過小，超過激光共聚焦顯微鏡分辨率；粒徑過大，導致所制備探針過大，引起聚集或影響后期應用。

優(yōu)選地，所述金種溶液的制備方法為：所述金種溶液的制備方法為：將1～5mM檸檬酸三鈉溶液100mL加熱攪拌，冷凝回流至沸騰，快速注入10～30mM?HAuCl₄溶液400μL，得到10nm的金種溶液。

優(yōu)選地，所述納米金溶液的制備方法為：將所述的金種溶液在原容器中降溫至90℃，注入10-30mM?HAuCl₄溶液400μL，30min反應結束后，重復以上步驟兩次；取出22mL樣品，注入1-5mM的檸檬酸三鈉22mL，作為種子溶液，重復本步驟4-6次，得40-50nm的納米金溶液。

優(yōu)選地，所述靶向分子為葉酸、透明質酸、多肽分子中的一種。

優(yōu)選地，所述離心洗滌的條件為4℃，12000-5000r/min，5min，洗滌液為去離子水；轉速過低造成探針的損失，過高可能會引起探針的聚集。

優(yōu)選地，所述納米金生物探針與細胞于37℃，體積含量5％CO₂的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)時間為30-120min。

優(yōu)選地，所述激光的波長為488-633nm。

與現有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：