[發明專利]人降鈣素原重組表達、單、多克隆抗體的制備及ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201410603936.3
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104531715A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 楊慧;黃慶生;唐蕊華;李晶;車速;李冀;劉亞雄;葉琳潔;邵燕;師俊玲
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/81;C12N15/70;C07K14/585;C07K16/26;G01N33/72
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人降鈣素原重組表達、單、多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：基因的合成

依據人源PCT基因序列，設計合成特異引物，應用PCR擴增全長PCT和N-PCT基因，并在全長PCT上下游引入HindIII、BamH?I酶切位點，在N-PCT上下游引入Spe?I、Xho?I酶切位點；

引物序列如下：

全長PCT引物序列5’-3’

全長F?TA?GGATCC?ATGGGCTTCCAAAAGTTCTCCC

全長R1

CTGCCTGCCTGCAACAGGACCAAGATGCTGAGAGCCAGGAAGGGGGAGAACTTTTGG

全長F1

CTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGGGCTGCTCTCCAGGGCAGACCTGAATGGTGCTGCAT

全長R2

TATGTGCCCAGCATGCAAGTACTCAGATTACCGCACCGCTTAGATCTGGGGCTGTC

全長F2

CCGGCCACGCTCAGTGAGGACGAAGCGCGCCTCCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACT

全長R3

TCTCTTGCTCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGT

全長F3

CAGGAGCAAGAGAGAGAGGGCTCCAGCCTGGACAGCCCCAGATCTAAGCGGTGCGGTA

全長R4

ATGCTGGGCACATACACGCAGGACTTCAACAAGTTTCACACGTTCCCCCAAACTGCAA

全長F4

TCGCTGGACATATCCCTTTTCTTTCCAGGTGCTCCAACCCCAATTGCAGTTTGGGGG

全長R

ATATGTCCAGCGACTTGGAGAGAGACCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCCCAGAATGC

N-PCT引物序列5’-3’

N-PCT-F?1

ATCTCGAGAAAAGAGCACCATTCAGGTCTGCCCTGGAGAGCAGCCCAGCAGACCCGGCC

N-PCT-R2

CCAGTGCAGCCAGCAGGAGGCGCGCTTCGTCCTCACTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGG

N-PCT-R3

TCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGTGCAGCCAGCA

N-PCT-R4

ATACTAGTCCGCTTAGATCTGGGGCTGTCCAGGCTGGAGCCCTCTCTCTCTTGC

(1)全長PCT基因的合成：取合成的10條互補引物各10μl混合均勻，共獲得100μl的引物混合液；從中再分別各取10μl、20μl、30μl混合液進行PCR反應獲取模板DNA；并以此作為全長基因合成的DNA模板，加入兩端特異引物，經PCR合成獲得全長PCT基因；

(2)N-PCT基因合成：取引物PCT?F1與PCT?R1進行PCR獲得片段1的雙鏈DNA(96bp)片段1再與PCT?R2進行退火延伸，獲得片段2雙鏈DNA(139bp)；片段2再與PCT?R3進行退火延伸，獲得片段3雙鏈DNA(193bp)，即PCT76-252的雙鏈DNA基因片段，以此片段為N-PCT合成模板，加入兩端特異引物進行PCR擴增反應，合成N-PCT基因；

步驟2：目的基因的重組表達及鑒定

(1)全長PCT擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定的凝膠，切下約425左右處的特異明亮條帶凝膠，放入EP管中，進行DNA的回收純化；取回收的產物15μl和已備pQE30載體15μ1分別進行雙酶切，并過夜連接；酶切體系為50μl：限制性內切酶HindIII1μl，限制性內切酶BamH?I?1μl，10x?K?buffer?5μl，DNA(PCT或pQE30)15μl，無菌水28μl；連接體系為T4連接酶1μl，目的基因(全長PCT)10μl，載體(pQE30)5μl，10x?ligation?buffer2μl，無菌水3μl；連接產物轉化DH5a感受態細胞，篩選陽性菌落，并進行菌液PCR和測序鑒定；陽性菌經IPTG誘導，表達重組全長PCT蛋白；

(2)同樣方法回收獲得的N-PCT基因與‘pPIC9K-ALB(白蛋白)’質粒載體分別進行酶切、連接；50μl酶切體系為：限制性內切酶Spe?I?1μl，限制性內切酶Xho?I?1μl，10xbuffer5μl，質粒15μl，無菌水28μl；連接體系為：T4連接酶1μl，無菌水3μl，目的基因10μl，10xligation?buffer?2μl，連接載體5μl；14℃連接過夜處理，連接產物轉化DH5a大腸桿菌，篩選陽性克隆；提取重組質粒經序列測定確認后電穿孔法轉化畢赤酵母菌感受態；G418抗性篩選高表達陽性菌株，甲醇誘導重組蛋白表達，取樣經12％SDS電泳及免疫印跡鑒定；

步驟：3：抗體制備及鑒定

(1)將重組表達的全長PCT融合蛋白作為免疫原免疫家兔，背部皮下多點注射完成一次免疫，一共免疫4-5次，每次免疫的蛋白量為400μg；第1次免疫與第二次免疫的時間間隔為12d，此后的免疫時間間隔為7d；第三次免疫完成后的3-4d，耳緣靜脈采血約2ml，4℃過夜放置，1200rpm/min離心5min收集血清，標準抗原包被酶標板；間接ELISA法檢測效價；

(2)N-PCT蛋白按常規方法免疫balb/c小鼠，取免疫小鼠脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞5∶1比例混合，PEG2000誘導細胞融合，經HAT培養基篩選，ELISA檢測有限稀釋法克隆化，免疫印跡鑒定，獲得一株穩定分泌抗N-PCT抗體的雜交瘤細胞株；

常規方法制備抗體腹水，利用商品化試劑盒PCT標準品抗原(福建洪誠生物公司提供)包被酶標板，進行腹水效價測定。