[發(fā)明專利]人降鈣素原重組表達(dá)、單、多克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410603936.3
• 申請(qǐng)日: 2014-10-27
• 公開（公告）號(hào): CN104531715A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊慧;黃慶生;唐蕊華;李晶;車速;李冀;劉亞雄;葉琳潔;邵燕;師俊玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/16
• 分類號(hào): C12N15/16;C12N15/81;C12N15/70;C07K14/585;C07K16/26;G01N33/72
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人降鈣素原重組表達(dá)、單、多克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是降鈣素(calcitonin，CT)的前肽物質(zhì)，是含116個(gè)氨基酸的糖蛋白。生理?xiàng)l件下，血中的降鈣素原主要由甲狀旁腺的C細(xì)胞合成。在胞內(nèi)，PCT會(huì)被逐步水解成為CT、抗鈣素(katacalcin)、N-端殘基三部分被分泌出細(xì)胞外。故血清PCT的濃度極低，且無較大波動(dòng)(＜50ng/L)，一般難以檢測(cè)。在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、濃毒血癥、敗血癥等嚴(yán)重細(xì)菌感染疾病條件下，患者身體其他部位的多種細(xì)胞均能大量合成PCT，并以蛋白原的形式分泌至胞外，導(dǎo)致血清中PCT顯著升高，其濃度可達(dá)正常水平的幾倍甚至上萬倍，研究還發(fā)現(xiàn)PCT濃度和感染嚴(yán)重程度成正相關(guān)，因而，相較于傳統(tǒng)的C-反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子、補(bǔ)體測(cè)定等檢測(cè)指標(biāo)，PCT蛋白憑借其自身早期性、穩(wěn)定性、特異性、正相關(guān)性的主要特點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)展成為快速診斷嚴(yán)重細(xì)菌感染、判斷細(xì)菌感染性疾病病情與預(yù)后及其療效觀察的可靠標(biāo)記物。

因此，不論在感染性疾病的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域還是在其防治領(lǐng)域，建立一種敏感、特異的PCT定量檢測(cè)方法，都具有重要的實(shí)用價(jià)值和十分廣闊的市場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種人降鈣素原重組表達(dá)、單、多克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法，該方法利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母真核表達(dá)?系統(tǒng)分別重組表達(dá)出了全長(zhǎng)的人PCT蛋白和N端PCT蛋白(N-PCT)作為免疫原，制備兔抗全長(zhǎng)PCT多克隆抗體和鼠抗N-PCT單克隆抗體；設(shè)計(jì)當(dāng)以原核表達(dá)的PCT作為免疫原制備多克隆抗體時(shí)，則用真核表達(dá)的N-PCT作為抗原來檢測(cè)與評(píng)價(jià)多克隆血清的效價(jià)與特異性。反之，當(dāng)以真核表達(dá)的N-PCT作為免疫原制備單克隆抗體時(shí)，則用原核表達(dá)的PCT作為抗原來檢測(cè)與評(píng)價(jià)單克隆抗體的效價(jià)與特異性，以消除多抗和單抗在篩選和評(píng)價(jià)過程中出現(xiàn)非特異反應(yīng)。并將獲得的抗體、抗原(重組PCT)通過組合配對(duì)實(shí)驗(yàn)，初步建立了能夠定量PCT蛋白的ELISA檢測(cè)方法，為PCT生物醫(yī)學(xué)診斷試劑盒研制和蛋白功能的深入研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。其具體技術(shù)方案為：

一種人降鈣素原重組表達(dá)、單、多克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1；基因的合成?

依據(jù)人源PCT基因序列，設(shè)計(jì)合成特異引物，應(yīng)用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)PCT和N-PCT基因，并在全長(zhǎng)PCT上下游引入HindIII、BamH?I酶切位點(diǎn)，在N-PCT上下游引入Spe?I、Xho?I酶切位點(diǎn)；

引物序列如下：

全長(zhǎng)PCT引物序列5’-3’

全長(zhǎng)F?TA?GGATCC?ATGGGCTTCCAAAAGTTCTCCC

全長(zhǎng)R1

CTGCCTGCCTGCAACAGGACCAAGATGCTGAGAGCCAGGAAGGGGGAGAACTTTTGG

全長(zhǎng)F1

CTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGGGCTGCTCTCCAGGGCAGACCTGAATGGTGCTGCAT

全長(zhǎng)R2

TATGTGCCCAGCATGCAAGTACTCAGATTACCGCACCGCTTAGATCTGGGGCTGTC

全長(zhǎng)F2

CCGGCCACGCTCAGTGAGGACGAAGCGCGCCTCCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACT

全長(zhǎng)R3

TCTCTTGCTCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGT

全長(zhǎng)F3

CAGGAGCAAGAGAGAGAGGGCTCCAGCCTGGACAGCCCCAGATCTAAGCGGTGCGGTA

全長(zhǎng)R4

ATGCTGGGCACATACACGCAGGACTTCAACAAGTTTCACACGTTCCCCCAAACTGCAA

全長(zhǎng)F4

TCGCTGGACATATCCCTTTTCTTTCCAGGTGCTCCAACCCCAATTGCAGTTTGGGGG

全長(zhǎng)R

ATATGTCCAGCGACTTGGAGAGAGACCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCCCAGAATGC