[發明專利]庫京病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201410602213.1
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104357582A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 孫肖紅;劉夢瑩;劉麗娟;白紅巖;劉鍵;林二妹
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 楊兵

技術領域

本發明屬于病毒檢測領域，具體涉及一種用于檢測庫京病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒和方法。

背景技術

庫京病毒(kunjin?virus，KUNV)屬于黃病毒屬，具有包膜的單股正鏈RNA病毒，是一種蚊媒病毒。國際委員會第七次報告上將庫京病毒歸類為西尼羅病毒(west?nile?virus，WNV)的亞型，其E基因與WNV譜系I的同源性可達80％。除環紋庫蚊外，還從Ae.tremulus，澳大利亞庫蚊，Cx.Squamous和致倦庫蚊中分離出了KUNV，其中致倦庫蚊在我國也有分布。

目前中國還沒有發現人類感染KUNV，但1990年有學者對西雙版納等地的猴血清進行了蟲媒病毒血清學調查，204份樣本中KUNV抗體陽性率達16.67％，表明野生猴類中有自然感染存在。

鑒于中國有多種庫蚊屬的蚊蟲，且具備WNV流行的生態學條件，因此KUNV作為WNV的一個亞種傳入中國的風險很大。加之我國與各國的貿易、旅游往來日益頻繁，所以，國境口岸對KUNV的監測，要求快速、敏感的檢測方法，對及時發現疫情，防止KUNV的傳入有重大意義，但是采用血清學的檢測方法，費時、費力，且檢測靈敏度低，不能滿足通關要求快速、高效、安全、低風險的目的。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一組用于檢測庫京病毒的核酸。本發明的另一個目的是提供一種用于檢測庫京病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒及其檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種用于PCR檢測庫京病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。

一組用于檢測庫京病毒的實時熒光RT-PCR核酸，該組核酸包括引物對、探針和作為陽性對照的擴增產物，所述引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，所述擴增產物為包含有如SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列。

一種檢測庫京病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括：

2×RT-PCR?buffer；

25×RT-PCRenzymeMix；

上游引物：核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；

探針：核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，所述探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；

陰性對照：無核酸酶水；

陽性對照：包含有核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示的基因。

如上所述的試劑盒，優選地，所述熒光基團為羧基熒光素(FAM)、三氫-吲哚菁型染料(CY3)中任意一種，所述淬滅基團為BHQ1、6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)、BHQ2中任意一種。

一種實時熒光RT-PCR方法檢測庫京病毒的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取病毒RNA；

(2)對提取的RNA進行實時熒光RT-PCR擴增；其中，RT-PCR擴增時，反應體系采用上下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示，探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示；

(3)收集熒光信號，選擇上述熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3～15個循環的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；

(4)結果判定：待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判斷為陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。

如上所述的實時熒光RT-PCR方法檢測庫京病毒的方法，優選地，所述步驟(2)中熒光RT-PCR擴增的反應體系具體如下：

1×RT-PCR?Buffer，

1×RT-PCR?Enzyme?Mix，

上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；

探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，

其中，所述探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；上下游引物和探針濃度分別為0.01～1μM，樣品RNA；同時設置無核酸酶水為陰性對照。

如上所述實時熒光RT-PCR方法檢測庫京病毒的方法，優選地，上下游引物濃度為400nmol/L，探針的終濃度為200nmol/L。