[發(fā)明專利]庫(kù)京病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410602213.1
• 申請(qǐng)日: 2014-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN104357582A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫肖紅;劉夢(mèng)瑩;劉麗娟;白紅巖;劉鍵;林二妹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 楊兵

1.一種用于PCR檢測(cè)庫(kù)京病毒的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。

2.一組用于檢測(cè)庫(kù)京病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸，其特征在于，該組核酸包括引物對(duì)、探針和作為陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，所述擴(kuò)增產(chǎn)物為包含有如SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列。

3.一種檢測(cè)庫(kù)京病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：

2×RT-PCR?buffer；

25×RT-PCRenzymeMix；

上游引物：核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；

探針：核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，所述探針5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

陰性對(duì)照：無核酸酶水；

陽(yáng)性對(duì)照：包含有核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示的基因。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)為FAM、CY3中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

5.一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)庫(kù)京病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取病毒RNA；

(2)對(duì)提取的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，其中，RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系中，采用上下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示，探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示；同時(shí)設(shè)置無核酸酶水為陰性對(duì)照；

(3)收集熒光信號(hào)；

(4)結(jié)果判定：待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過閾值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性，如無典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體如下：1×RT-PCR?Buffer，1×RT-PCR?Enzyme?Mix，上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，所述探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；上下游引物和探針濃度分別為0.01～1μM，樣品RNA；同時(shí)設(shè)置無核酸酶水為陰性對(duì)照。

7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述上下游引物濃度為400nmol/L，探針的終濃度為200nmol/L。

8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)收集熒光信號(hào)包括，選擇上述熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線。