[發明專利]鑒定豬FRZB基因中SNP位點基因型的方法

在審

• 申請號: 201410601935.5
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104404136A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 張浩;王志秀;李慶崗;商鵬;張博
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及一種基因型檢測方法，具體的，涉及一種鑒定豬FRZB基因中與生長性狀相關的SNP位點基因型的方法及其應用。

背景技術

FRZB(Frizzled?motif?associated?with?bone?development)基因編碼分泌型卷曲相關蛋白3(secreted?frizzled-related?protein?3,sFRP3)，該蛋白富含半胱氨酸結構域(CRD)，該結構域同源于細胞表面卷曲受體(frizzled?receptors)的Wnt結合位點,因此FRZB基因通過競爭性結合參與和調控Wnt信號途徑。Wnt信號通路在調控細胞的增殖和分化、胚胎發育過程中起著重要作用。研究表明，Wnt信號通路異常與人類的很多疾病有關系。sFRP3可直接結合Wnt蛋白，阻斷Wnt信號轉導，是Wnt信號的天然拮抗劑。研究表明，sFPR3是一種軟骨形成因子，與骨骼發育有關，具有調節骨骼發育功能，在決定髖骨的形狀中起著重要作用，調控四肢骨骼肌發育中軟骨細胞成熟和長骨發育。以上研究表明了FRZB基因在人和小鼠中生長發育方面的重要作用，目前對于該基因在豬上的研究比較少。

目前有研究發現，淮豬新品系群體中FRZB基因的C-416T位點存在3種基因型。CC基因型個體生長最快，達30kg體重日齡比CT和TT型個體分別縮短4.1d和5.0d，達90kg體重日齡分別縮短12.0d和24.7d，CC基因型的90kg體重日齡與TT型差異顯著，可看出C等位基因對提高生長速度是有利的，CC是有利基因型。因此在淮豬新品系豬群中可以選擇CC基因型個體進行留種，從而提高豬群的生長速度，加速新品系的選育進程。但是，對于FRZB基因C-416T基因型的鑒定，目前只有PCR產物測序法，價格比較貴。因此，針對C-416T處的SNP位點，需要發掘一種結果準確、操作簡單、成本低廉的基因型檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種FRZB基因C-416T(起始密碼子上游416bp)處SNP位點基因型的鑒定方法。

為此，本發明提供了一種鑒定豬FRZB基因中起始密碼子上游416bp處SNP位點基因型的方法，包括以下步驟：

步驟一：以豬基因組DNA為模板利用SEQ?ID?NO:1所示的序列為正向引物、SEQ?ID?NO:2所示的序列為反向引物進行PCR擴增獲得PCR產物；

步驟二：利用限制性內切酶對PCR產物進行酶切獲得酶切片段；

步驟三：對酶切片段進行瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳圖，依據電泳圖中酶切片段的長度鑒定基因型。

優選的，所述限制性內切酶為內切酶Nde?Ⅰ。

在本發明中，電泳圖顯示僅有長度為262bp的酶切片段，鑒定所述SNP位點的基因型為CC型。

在本發明中，電泳圖顯示有長度為262bp和289bp的酶切片段，鑒定所述SNP位點的基因型為CT型。

在本發明中，電泳圖顯示僅有長度為289bp的酶切片段，鑒定所述SNP位點的基因型為TT型。

優選的，PCR擴增的工作反應程序為：94-95℃預變性3-5min；94-95℃變性20-30s，50-60℃退火20-30s，72℃延伸20-30s，30-36個循環；72℃延伸5-8min。

優選的，所述瓊脂糖凝膠電泳的條件包括：利用濃度為1-1.5％的瓊脂糖凝膠，在120-130V電壓下電泳30-40min。

利用本發明所提供的方法，可以對豬FRZB基因中起始密碼子上游416bp處SNP位點基因型進行快速、準確的鑒定。

附圖說明

圖1為豬FRZB基因5’側翼區序列PCR擴增結果示意圖；

M為DM2000?plus?Marker，C為陰性對照組，1-9泳道中為待測樣品1-9，箭頭所指處為250bp。

圖2為豬FRZB基因SNP位點基因型鑒定電泳圖；

M為DM2000?plus?Marker，1-9泳道中為待測樣品1-9，箭頭所指處為250bp。

圖3為樣品1、2和4的PCR擴增產物測序結果示意圖；

A為樣品1PCR擴增產物測序結果示意圖；B為樣品2?PCR擴增產物測序結果示意圖；C為樣品4?PCR擴增產物測序結果示意圖；虛線畫出的部分為SNP位點。圖中標出的SNP位點與說明書中描述的”FRZB基因起始密碼子上游416bp處SNP位點”和序列表中描述的“259mutation”是一致的位點。