[發(fā)明專利]一種利用流式細(xì)胞儀測(cè)定土壤中噬菌體豐度的方法

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• 申請(qǐng)日: 2014-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN104483290A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏云林;孫策;季秀玲;李珊;林連兵;張琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/47
• 分類號(hào): G01N21/47;G01N35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及一種測(cè)定土壤中噬菌體豐度的方法，特別是一種利用流式細(xì)胞儀測(cè)定土壤中噬菌體豐度的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域，專用于土壤中噬菌體豐度的快速鑒定。

背景技術(shù)

????噬菌體在自然環(huán)境中數(shù)量巨大，在調(diào)節(jié)微生物種群的結(jié)構(gòu)與多樣性、促進(jìn)微生物間遺傳物質(zhì)的傳遞與協(xié)同進(jìn)化、參與微食物環(huán)的形成等方面發(fā)揮重要角色。噬菌體對(duì)宿主菌的每一次感染都潛在著將新的遺傳信息導(dǎo)入宿主菌的可能。不論是在實(shí)驗(yàn)室還是自然界環(huán)境中，越來(lái)越多的證據(jù)表明在微生物群落的生態(tài)和進(jìn)化過(guò)程中細(xì)菌和噬菌體共同進(jìn)化是關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。

????噬菌體作為微食物環(huán)中重要的成分，對(duì)傳統(tǒng)意義“微生物食物環(huán)”中的主要成分均有相當(dāng)程度的影響，它使得微生物食物環(huán)變得更加復(fù)雜。病毒可在各式各樣的環(huán)境中存在，是自然環(huán)境中重要而完整的部分。而病毒豐度的變化往往與環(huán)境中的溫度、元素等其他因素相關(guān)聯(lián)。在摸索并建立起病毒豐度與環(huán)境的相應(yīng)規(guī)律后，也可以通過(guò)病毒來(lái)對(duì)環(huán)境變化進(jìn)行指示。

????由于病毒體積微小，多數(shù)病毒直徑在20-200?nm之間。而傳統(tǒng)方法一般是將土樣制備成懸浮液后，分別用直接過(guò)濾除菌和切向流的膜濃縮樣品的方法分別獲得細(xì)菌液和混合病毒液，超速離心后將病毒和細(xì)菌在金屬網(wǎng)格上進(jìn)行負(fù)染，利用透射電鏡觀察病毒樣顆粒和細(xì)菌形態(tài)，按形態(tài)分類統(tǒng)計(jì)后計(jì)算噬菌體豐度。還有利用SYBR-GreenⅠ熒光染料對(duì)超速離心后的病毒和細(xì)菌濃縮液染色，在熒光顯微鏡下對(duì)病毒樣顆粒和細(xì)菌顆粒計(jì)數(shù)，測(cè)定非培養(yǎng)條件下噬菌體和細(xì)菌總數(shù)，但是估算計(jì)數(shù)的精度不夠高，誤差較大，重復(fù)性較差。對(duì)于可培養(yǎng)的噬菌體大多采用測(cè)定效價(jià)來(lái)計(jì)算噬菌體的豐度，而自然界中可培養(yǎng)的微生物種類不到1%，而且可培養(yǎng)噬菌體豐度的測(cè)定必須基于宿主細(xì)菌的分離培養(yǎng)，因此成本高、時(shí)間久。

?????根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，流式細(xì)胞儀測(cè)定噬菌體豐度的主要原理是使特異性核酸熒光染料與噬菌體的核酸物質(zhì)相結(jié)合，根據(jù)其在流式細(xì)胞儀上所顯示出的側(cè)向散射光（與大小有關(guān)）和綠熒光（與核酸含量有關(guān)）信號(hào)來(lái)進(jìn)行區(qū)分及計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞儀作為一種以單細(xì)胞為對(duì)象的檢測(cè)技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于能快速分析大量細(xì)胞，并獲取數(shù)據(jù)易于進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析，還能檢測(cè)低濃度下的細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)下限與靈敏度都得以提高，準(zhǔn)確性提高，誤差減小，具有快速、客觀準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)臨床研究中的應(yīng)用十分廣泛，但在土壤微生物尤其是噬菌體豐度測(cè)定中的應(yīng)用相對(duì)較少，且先前相關(guān)報(bào)道得知處理土樣的方法只是用無(wú)菌水進(jìn)行溶解離心和過(guò)膜的簡(jiǎn)單處理，存在較大誤差與不穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種利用流式細(xì)胞儀測(cè)定土壤中噬菌體豐度的方法，針對(duì)現(xiàn)有的傳統(tǒng)方法估算計(jì)數(shù)的精度不夠高的問(wèn)題，將流式細(xì)胞儀應(yīng)用于噬菌體豐度的測(cè)量，分析噬菌體豐度與水文參數(shù)間的關(guān)系，初步建立測(cè)量方法，從而更好的揭示環(huán)境微生物中生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系；根據(jù)此前相關(guān)文獻(xiàn)處理土樣的方法只是用無(wú)菌水進(jìn)行溶解離心和過(guò)膜的簡(jiǎn)單處理，存在較大誤差與不穩(wěn)定性，所以在土樣處理過(guò)程中，通過(guò)分別添加Tween80和焦磷酸鈉逐步摸索條件并做了進(jìn)一步優(yōu)化，最后測(cè)得同時(shí)添加Tween80和焦磷酸鈉測(cè)得的噬菌體豐度更高，而且更加準(zhǔn)確，從而更加真實(shí)的反應(yīng)環(huán)境中噬菌體的豐度，為進(jìn)一步了解病毒在微生物食物環(huán)乃至整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)中的地位及其在生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用提供了便利。

本發(fā)明利用流式細(xì)胞儀測(cè)定土壤中噬菌體豐度的方法，包括以下步驟：

（1）稱取1~10?g土樣，加入10~30?ml?經(jīng)過(guò)0.02?um濾膜過(guò)濾的pH=8的TE?buffer，渦旋震蕩1~10?min后，加入體積百分比10~15%的Tween80?50~100μl、1~10?mM的焦磷酸鈉1~10ml，充分震蕩混勻后超聲30~45s，停止30~60s，重復(fù)3~5次，離心前充分震蕩，1000~1500?g離心1~5?min，2500~3000?g進(jìn)行二次離心1~10?min，上清液經(jīng)過(guò)布氏漏斗過(guò)濾，收集濾液；按終濃度為1μg/ml的比例向?yàn)V液中加入DNAse?I（脫氧核糖核酸酶I）和RNAse?A（核糖核酸酶A），在37℃或室溫中消化30?min后，按樣品終濃度為0.5%（v/v）的比例在分裝有樣品的凍存管中加入質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛，4℃避光固定15~20?min后，放入液氮迅速冷凍后，于-80℃保存；