[發明專利]一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法

在審

• 申請號: 201410595919.X
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104483290A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 魏云林;孫策;季秀玲;李珊;林連兵;張琦
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: G01N21/47
• 分類號: G01N21/47;G01N35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，其特征在于按如下步驟進行：

（1）稱取1~10?g土樣，加入10~30?ml?經過0.02?μm濾膜過濾的pH=8的TE?buffer，渦旋震蕩1~10?min后，加入體積百分比10~15%的Tween80?50~100μl、1~10?mM的焦磷酸鈉1~10ml，充分震蕩混勻后超聲30~45s，停止30~60s，重復3~5次，離心前充分震蕩，1000~1500?g離心1~5?min，2500~3000?g進行二次離心1~10?min，上清液經過布氏漏斗過濾，收集濾液；按終濃度為1μg/ml的比例向濾液中加入DNAse?I和RNAse?A，在37℃或室溫中消化30?min后，按樣品終濃度為0.5%?v/v的比例在分裝有樣品的凍存管中加入質量百分比濃度為25%的戊二醛，4℃避光固定15~20?min后，放入液氮迅速冷凍后，于-80℃保存；

（2）用濾過的pH=8的TE?buffer將10000×SYBR?Gold和10000×SYBR?Green?I分別稀釋到100×SYBR?Gold、100×SYBR?Green?I，將步驟（1）樣品取出后，37℃水浴解凍，按終濃度為0.5×染液的比例將100×染液加入到步驟（1）樣品中，常溫避光染色5?min后，80℃水浴鍋中孵育10?min，避光冷卻到室溫；流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FL1-H進行檢測；

（3）將已染色的樣品進行上樣，在分析軟件中建立SSC-H/FL1-H散點圖，調整并確定流式細胞儀的前向角散射光FL1-H和側向角散射光SSC-H，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點，在SSC-H/FL1-H散點圖上根據核酸含量圈定噬菌體范圍，通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI?2.9計算機分析軟件分析散點圖上噬菌體范圍和計數。