[發(fā)明專利]一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410595919.X | 申請日： | 2014-10-30 |
| 公開（公告）號： | CN104483290A | 公開（公告）日： | 2015-04-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 魏云林;孫策;季秀玲;李珊;林連兵;張琦 | 申請（專利權(quán)）人： | 昆明理工大學 |
| 主分類號： | G01N21/47 | 分類號： | G01N21/47;G01N35/00 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 650093 云*** | 國省代碼： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 細胞 測定 土壤 噬菌體 方法 | ||
1.一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，其特征在于按如下步驟進行：
（1）稱取1~10?g土樣，加入10~30?ml?經(jīng)過0.02?μm濾膜過濾的pH=8的TE?buffer，渦旋震蕩1~10?min后，加入體積百分比10~15%的Tween80?50~100μl、1~10?mM的焦磷酸鈉1~10ml，充分震蕩混勻后超聲30~45s，停止30~60s，重復(fù)3~5次，離心前充分震蕩，1000~1500?g離心1~5?min，2500~3000?g進行二次離心1~10?min，上清液經(jīng)過布氏漏斗過濾，收集濾液；按終濃度為1μg/ml的比例向濾液中加入DNAse?I和RNAse?A，在37℃或室溫中消化30?min后，按樣品終濃度為0.5%?v/v的比例在分裝有樣品的凍存管中加入質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛，4℃避光固定15~20?min后，放入液氮迅速冷凍后，于-80℃保存；
（2）用濾過的pH=8的TE?buffer將10000×SYBR?Gold和10000×SYBR?Green?I分別稀釋到100×SYBR?Gold、100×SYBR?Green?I，將步驟（1）樣品取出后，37℃水浴解凍，按終濃度為0.5×染液的比例將100×染液加入到步驟（1）樣品中，常溫避光染色5?min后，80℃水浴鍋中孵育10?min，避光冷卻到室溫；流式細胞儀檢測時，選擇側(cè)向角SSC-H和通道FL1-H進行檢測；
（3）將已染色的樣品進行上樣，在分析軟件中建立SSC-H/FL1-H散點圖，調(diào)整并確定流式細胞儀的前向角散射光FL1-H和側(cè)向角散射光SSC-H，進樣量設(shè)定在散點圖上持續(xù)打出10000個點，在SSC-H/FL1-H散點圖上根據(jù)核酸含量圈定噬菌體范圍，通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI?2.9計算機分析軟件分析散點圖上噬菌體范圍和計數(shù)。
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- 專利分類
G01N 借助于測定材料的化學或物理性質(zhì)來測試或分析材料
G01N21-00 利用光學手段，即利用紅外光、可見光或紫外光來測試或分析材料
G01N21-01 .便于進行光學測試的裝置或儀器
G01N21-17 .入射光根據(jù)所測試的材料性質(zhì)而改變的系統(tǒng)
G01N21-62 .所測試的材料在其中被激發(fā)，因之引起材料發(fā)光或入射光的波長發(fā)生變化的系統(tǒng)
G01N21-75 .材料在其中經(jīng)受化學反應(yīng)的系統(tǒng)，測試反應(yīng)的進行或結(jié)果
G01N21-84 .專用于特殊應(yīng)用的系統(tǒng)
