[發明專利]鑒別鼓槌石斛和球花石斛的分子特異性標記引物及方法

無效

• 申請號: 201410593364.5
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104313162A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 王慧中;馮尚國;史鈺軍;何仁鋒;陳喆
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

技術領域

本發明涉及一種鑒別鼓槌石斛Dendrobium?chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum的分子特異性標記引物，以及一種利用該特異性引物對鼓槌石斛和球花石斛標本快速鑒別的方法。

背景技術

鼓槌石斛Dendrobium?chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum均隸屬于蘭科(Orchidaceae)石斛屬Dendrobium下的頂葉組(Sect.Chrysotoxae?Kraenzl.)。二者是中國傳統名貴藥材，具有滋陰養胃、潤肺止咳、清熱明目之功效，另外，還有增強人體免疫力，消除腫瘤，抑制癌癥等作用。其中鼓槌石斛D.chrysotoxum被中華人民共和國藥典(2010版)收錄，并列為重點保護的野生珍貴藥材品種。鼓槌石斛和球花石斛的莖、葉型、花型和花色都非常相似，從形態學上很難將二者相似種輕易鑒別開。因而在過去的很多年里，將鼓槌石斛D.chrysotoxum錯誤鑒定為球花石斛D.thyrsiflorum的情況時有發生。事實上，D.chrysotoxum與D.thyrsiflorum并非同種，這一結論已經得到了分子數據的支持。

對D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum這兩個相似種辨別的主要特征是宏觀上差異并不是很顯著的莖的形狀。但是由于二者莖的形狀易受生境、氣候、生理狀況等的影響而常常導致主觀辨別上的偏差，而對長期保存的標本，特別是對古老標本、模式標本的重新鑒別，僅靠莖的形狀差異更是難以準確鑒定。因此，在石斛分類研究上，分子標記技術成為了對石斛樣本輔助鑒別的重要手段。

真核生物的核糖體基因rRNA的內轉錄間隔區(Internal?Transcribed?Spacer,ITS)的保守性非常強。種內ITS序列相對一致，而種間差異比較明顯，這一特點使得ITS序列不僅適合于屬內物種間的系統發育分析，而且非常適合于植物物種的分子鑒定。對D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum的ITS區序列測序結果顯示，D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum的ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列長度均為641bp。因此，很難利用通用ITS引物(ITS4/ITS5)的PCR擴增、普通電泳對兩個相似種進行準確鑒別。通過對兩個相似種的ITS序列比對分析發現二者的局部序列存在堿基差異，本研究根據這一特點，設計開發了用于鑒定鼓槌石斛的ITS特異性引物。本發明為兩個相似種的分子輔助鑒別提供了可能性，對有效的鑒別和保護兩種石斛種質資源具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的一個目的是針對現有技術的不足，提供了一種可鑒別鼓槌石斛D.chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum的分子特異性標記引物。

本發明一種鑒別鼓槌石斛D.chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum的分子特異性標記引物，其核苷酸序列如下：

上游引物GCF：5’-CAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGC-3’，如SEQ?ID?NO.1所示；

下游引物GCR：5’-ATGGATCGACGCATGGTTTGGGA-3’，如SEQ?ID?NO.2所示。

此對分子特異性引物是采用普通PCR技術，經過對鼓槌石斛D.chrysotoxum標本和球花石斛D.thyrsiflorum標本的核糖體ITS區序列的克隆測序，然后對測序獲得的兩個相似種ITS序列進行堿基差異比對，并以此設計分子特異性引物(GCF/GCR)。上述引物對具有極高的專一性，用此對引物對D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum進行PCR擴增，可以從D.chrysotoxum中獲得582bp大小的特異性片段。

本發明還涉及上述開發的分子特異性引物(GCF/GCR)在鑒別鼓槌石斛D.chrysotoxum標本和球花石斛D.thyrsiflorum標本中的應用。

本發明的另一個目的是提供利用上述分子特異性標記引物對鼓槌石斛和球花石斛進行快速鑒別的方法。

本發明采用上述分子特異性標記引物(GCF/GCR)作為特異性擴增引物，以待測石斛標本基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現582bp的DNA帶譜，則待測石斛樣本為鼓槌石斛D.chrysotoxum；若電泳結果未出現582bp的DNA帶譜，則待測石斛樣本為球花石斛D.thyrsiflorum。