[發明專利]A型通用流感病毒的數字PCR檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201410592623.2
• 申請日: 2014-10-29
• 公開（公告）號: CN104388582A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 雷永良;劉敏;陳秀英;王曉光;葉靈;葉碧峰;梅建華
• 申請（專利權）人: 雷永良
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 周涌賀

技術領域

本發明涉及一種A型通用流感病毒的數字PCR檢測試劑盒機檢測方法，可應用于A型通用流感病毒引起的實驗室應急檢測。

背景技術

目前，原有的定量PCR對原有的樣本核酸只能進行相對定量，需要依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，是對起始樣品的絕對定量。依靠Ct值常不能很好分辨：拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。而目前的熒光檢測方法周期長，且對病毒是否為陽性的檢測存在不確定結果，導致多次檢測，或檢測結果不準確。

發明內容

本發明要解決上述現有技術存在的問題，提供一種能夠直接數出DNA分子的個數的方法，大大提高了檢測靈敏度、精確性，適合重大傳染病的早期篩查。

本發明解決其技術問題采用的技術方案：這種A型通用流感病毒的數字PCR檢測試劑盒，包括逆轉錄酶、數字PCR緩沖液PCRMasterMix、A型流感病毒基因標準品，數字PCR檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，上游引物、下游引物和特異性探針序列如下：

上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；

下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；

特異性探針A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’；

其中FAM為熒光報告基團，BHQ1為熒光淬滅基團；

其中A型流感病毒基因標準品序列如下：

GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT。

其中數字PCR檢測試劑盒中組分含有：

這種A型通用流感病毒的數字PCR檢測方法，按照以下步驟進行：

(1)打開兩份病毒核酸樣品放入試管中，分別放入水浴42℃，金屬浴65℃中，提取病毒核酸待檢樣本RNA；

(2)在試管中加入10ul的逆轉錄酶，10ul的逆轉錄酶由5ul的RNA模版、3ul的dH2O、1ul的Oligo或Random6引物、1ul的dNTP組成，將待檢樣本RNA逆轉錄為cDNA；

(3)在65℃環境中放置5min，然后在冰上快速冷卻；該步通過RNA模板變性增強反轉錄效果

(4)加入4.5ul的dH2O、4ul的5*buffer、1ul的RTase和0.5ul的TNase抑制劑；

(5)輕輕混合均勻，在42℃的環境中放置30～60min；

(6)在95℃5min滅活酶，冰中保存；

(7)體系加入樣本模板cDNA，每個20ul反應體系中含10ul數字PCR緩沖液PCRMasterMix，250nM探針，900nM引物，反應溫度為：先95℃10min，再94℃30s→58℃60s，這樣不停地循環變換溫度40次；然后放在98℃的溫度下10min，4℃保存或分析。溫度變換的作用是熒光信號嵌入到病毒核酸中，使紫外讀取儀能識別病毒，如果是陰性樣品，隨著儀器溫度的升降，探針中熒光信號并不能嵌入，所以儀器判讀結果為無信號。

(8)通過儀器讀取20000個微孔中的熒光值。

這種數字PCR原理是微滴化處理，將每個樣品分形成20,000個液滴，主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器孔中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

為了進一步完善PCR儀器對于檢測病毒量少的樣本，ct值介于30～40之間的陽性不確定情況，本實驗大大提高微量檢測能力，進一步完善檢測下限，給出更可靠的數據，進一步完善檢測精確度，使樣本核酸載量不再依靠標準品來推算，避免得出結果值波動幅度，明確定量樣品中的核酸數量。