[發(fā)明專利]A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410592623.2
• 申請(qǐng)日: 2014-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN104388582A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雷永良;劉敏;陳秀英;王曉光;葉靈;葉碧峰;梅建華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 雷永良
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務(wù)所有限公司 33241
• 代理人: 周涌賀

1.一種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、數(shù)字PCR緩沖液PCRMasterMix、A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，其特征是：所述數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，所述上游引物、下游引物和特異性探針序列如下：

上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；

下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；

特異性探針A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’，

其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)；

所述A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：

GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒，其特征是：所述數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒中組分含有：

3.一種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測(cè)方法，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)打開兩份病毒核酸樣品放入試管中，分別放在水浴42℃、金屬浴65℃中，提取病毒核酸待檢樣本RNA；

(2)在試管中加入10ul的逆轉(zhuǎn)錄酶，10ul的逆轉(zhuǎn)錄酶由5ul的RNA模版、3ul的dH₂O、1ul的Oligo或Random6引物、1ul的dNTP組成，將待檢樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(3)在65℃環(huán)境中放置5min，然后在冰上快速冷卻；

(4)加入4.5ul的dH₂O、4ul的5*buffer、1ul的RTase和0.5ul的TNase抑制劑；

(5)輕輕混合均勻，在42℃的環(huán)境中放置30^～60min；

(6)在95℃5min滅活酶，冰中保存；

(7)體系加入樣本模板cDNA，每個(gè)20ul反應(yīng)體系中含10ul數(shù)字PCR緩沖液PCRMasterMix，250nM探針，900nM引物，反應(yīng)溫度為：先95℃10min，再94℃30s→58℃60s，這樣不停地循環(huán)變換溫度40次；然后放在98℃的溫度下10min，4℃保存或分析；

(8)通過儀器讀取20000個(gè)微孔中的熒光值。