[發(fā)明專利]利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌及制備方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410588693.0
• 申請日: 2014-10-28
• 公開（公告）號: CN104328061A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設計）人: 朱明軍;區(qū)健發(fā);謝文化
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌及制備方法與應用。

背景技術

木質纖維素是一類豐富而廉價的可再生資源，是生產(chǎn)燃料乙醇的主要材料，經(jīng)水解后，可得到以葡萄糖和木糖為主的發(fā)酵性糖。木糖的有效利用是木質纖維素生物轉化生產(chǎn)乙醇的關鍵環(huán)節(jié)之一。釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae從人類有記載以來就一直是生產(chǎn)乙醇的首選，是目前在工業(yè)規(guī)模上發(fā)酵玉米淀粉和其他糖類化合物產(chǎn)乙醇的菌株，耗糖迅速快、乙醇耐受能力強，在生物質轉化中潛力具大。但釀酒酵母不能利用木糖，鑒于自然界缺少能高效轉化木糖生產(chǎn)乙醇的釀酒菌種，近年來通過基因工程技術獲得了多種不同類型的木糖發(fā)酵工程菌株，其中釀酒酵母是主要研究對象。但仍存在許多技術難題，具有進一步提升的空間。

釀酒酵母工程菌株中普遍存在的問題可總結為：碳源代謝抑制、胞內戊糖代謝通路中的氧化還原失衡、以及底物攝取能力低下，在整個木質纖維素的發(fā)酵過程中，作為發(fā)酵菌株的釀酒酵母還面臨著來自環(huán)境和物料、遺傳途徑、胞內調節(jié)幾方面的壓力。然而目前對這些問題尚未有有效的解決辦法，將新型外源基因用于構建釀酒酵母木糖代謝途徑，可進一步了解其它菌株的代謝機制，是一種提高木糖發(fā)酵能力的有效策略，對豐富微生物代謝工程的認識有重要價值。

根據(jù)代謝工程理論，構建能利用木糖產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌株的重要途徑之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的兩個關鍵酶基因，木糖還原酶基因XYL1(xylose?reductase，XR)和木糖醇脫氫酶基因XYL2(xylitol?dehydrogenase,XDH)，并使其在釀酒酵母細胞中表達。代謝通路中緊接著XYL1和XYL2的木酮糖激酶基因XKS(xylulokinase,XK)也往往是酵母菌代謝木糖的瓶頸。引入外源XYL1、XYL2，過表達宿主菌的XKS，有望得到高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的工程菌株。

發(fā)明內容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌。該釀酒酵母工程菌可以以木糖為唯一碳源，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌，含有如下核苷酸序列：如SEQ?ID?NO.1所示的木糖還原酶基因、如SEQ?ID?NO.2所示的木糖醇脫氫酶基因和如SEQ?ID?NO.3所示的木酮糖激酶基因；

所述的木糖還原酶基因來自葡萄牙假絲酵母；尚未有利用該基因的報道；

所述的木糖醇脫氫酶基因來自葡萄牙假絲酵母；尚未有利用該基因的報道；

所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌中過表達；

所述的過表達優(yōu)選為使用強啟動子啟動木酮糖激酶基因的轉錄；

所述的強啟動子優(yōu)選為磷酸甘油激酶啟動子；

所述利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌，優(yōu)選含有如下核苷酸序列：啟動子1+如SEQ?ID?NO.1所示的木糖還原酶基因+終止子1、啟動子2+如SEQ?ID?NO.2所示的木糖醇脫氫酶基因+終止子2和啟動子3+SEQ?ID?NO.3所示的木酮糖激酶基因+終止子3；

所述的啟動子1優(yōu)選為組成型啟動子，特別優(yōu)選為磷酸丙糖異構酶啟動子(pTPI1)，其來自釀酒酵母；

所述的終止子1優(yōu)選為磷酸丙糖異構酶終止子(tTPI1)，其來自釀酒酵母；

所述的啟動子2優(yōu)選為組成型啟動子，特別優(yōu)選為己糖轉運蛋白HXT7的啟動子(pHXT7)，其來自釀酒酵母；

所述的終止子2優(yōu)選為CYC1終止子，其來自載體pYES2；

所述的啟動子3優(yōu)選為組成型強啟動子，保證了木酮糖激酶基因過表達；特別優(yōu)選為磷酸甘油激酶啟動子(pPGK1)；

所述的終止子3優(yōu)選為木酮糖激酶終止子；

所述的核苷酸序列優(yōu)選為整合到所述釀酒酵母工程菌的染色體上；

所述的利用木糖進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母工程菌的出發(fā)菌株優(yōu)選為釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?CICC?1917；