[發明專利]利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌及制備方法與應用

在審

• 申請號: 201410588693.0
• 申請日: 2014-10-28
• 公開（公告）號: CN104328061A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 朱明軍;區健發;謝文化
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

1.一種利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列：如SEQ?ID?NO.1所示的木糖還原酶基因、如SEQ?ID?NO.2所示的木糖醇脫氫酶基因和如SEQ?ID?NO.3所示的木酮糖激酶基因。

2.根據權利要求1所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于：所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌中過表達。

3.根據權利要求1所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列：啟動子1+如SEQ?ID?NO.1所示的木糖還原酶基因+終止子1、啟動子2+如SEQ?ID?NO.2所示的木糖醇脫氫酶基因+終止子2和啟動子3+SEQ?ID?NO.3所示的木酮糖激酶基因+終止子3。

4.根據權利要求1所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于：所述的啟動子1為磷酸丙糖異構酶啟動子；

所述的終止子1為磷酸丙糖異構酶終止子；

所述的啟動子2為己糖轉運蛋白HXT7的啟動子；

所述的終止子2為CYC1終止子；

所述的啟動子3為磷酸甘油激酶啟動子；

所述的終止子3為木酮糖激酶終止子。

5.根據權利要求1所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于：所述的核苷酸序列為整合到所述釀酒酵母工程菌的染色體上。

6.根據權利要求1所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌的出發菌株為釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?CICC?1917。

7.根據權利要求1所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌為名稱為釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)004-PGK的菌株，其于2014年8月20日保藏在位于中國武漢武漢大學內的中國典型培養物保藏中心、保藏號為CCTCC?NO：M?2014385。

8.權利要求1～7任一項所述利用木糖進行乙醇發酵的釀酒酵母工程菌的制備方法，其特征在于包含如下步驟：

(1)設計如下引物，引物方向均為5'-3'：

3sites?oligo?dT：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT；

XYL1-DEG-F：ATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC；

XYL1-DEG-R：ATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC；

XYL2-DEG-F：GTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYGG；

XYL2-DEG-R：CAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA；

xyl1?3sites?F：CTTGAACCTCGAGTACCTTG；

xyl2?3sites?F：CCACATCCAAAGAAGGCGAAC；

3sites?Adaptor：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；

5sites?Tri-G：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG；

xyl1?5sites?R：AAGTCGCTCAATGTCTTGTCC；

xyl2?5sites?R：TGGTCTGGCAACTTAACCAA；

5sites?Adaptor：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC；

xyl1-cDNA-F：GCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT；

xyl1-cDNA-R：AATATGACTAATAGAAGGTAATTTT；

xyl2-cDNA-F：CCACCTCAAGGTATGAGCCTAT；

xyl2-cDNA-R：AACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT；

pXKS1-F：GGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT；

pXKS1-R：GGGCCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT；

pPGK1-F：GGGCCCGGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG；

pPGK1-R：GGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA；

XKS1?ORF-F：GGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA；

XKS1?ORF-R：GGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA；

XKS1-ext-R：GCGCTAATTTGATTTGTCT；

pTPI1-F：GGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTTC；

pTPI1-R：GGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT；

xyl1-F：GGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA；

xyl1-R：TTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT；

tTPI1-F：AAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA；

tTPI1-R：CATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG；

pHXT7-F：CAACTGTTATATAGAAGAGCGAGCTCCCGTGGAAATGAGGGGTATG；

pHXT7-R：TGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA；

xyl2-F：TTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT；

xyl2-R：GGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA；

(2)獲得木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因

①提取葡萄牙假絲酵母的總RNA，使用引物3sites?oligo?dT進行反轉錄，得到cDNA；

②以得到的cDNA作為模板，使用引物對XYL1-DEG-F+XYL1-DEG-R以及引物對XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R分別進行PCR，PCR產物經過純化后與T載體連接，測序后證明是木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的部分序列；

③3’RACE：以步驟①得到的cDNA為模板，分別使用特異引物xyl1?3sites?F和xyl2?3sites?F結合3sites?Adaptor引物進行PCR反應，PCR產物純化后連接T載體后測序；

④5’RACE：提取葡萄牙假絲酵母的總RNA，使用引物3sites?oligo?dT和5sites?Tri-G進行反轉錄，得到cDNA；以該cDNA為模板，分別使用特異引物xyl1?5sites?R和xyl2?5sites?R結合5sites?Adaptor引物進行PCR反應，PCR產物純化后連接T載體后測序；

⑤再以步驟①得到的cDNA為模板，使用xyl1-cDNA-F和xyl1-cDNA-R為引物對，PCR得到木糖還原酶基因；使用xyl2-cDNA-F和xyl2-cDNA-R為引物對，PCR得到木糖醇脫氫酶基因；

(3)獲得木酮糖激酶啟動子片段、磷酸甘油激酶啟動子片段、木酮糖激酶基因片段、磷酸丙糖異構酶啟動子片段、磷酸丙糖異構酶終止子片段、葡萄糖轉運蛋白HXT7啟動子片段

以釀酒酵母基因組DNA為模板，以pXKS1-F和pXKS1-R為引物對，PCR得到木酮糖激酶啟動子片段；以pPGK1-F和pPGK1-R為引物對，PCR得到磷酸甘油激酶啟動子片段；以XKS1?ORF-F和XKS1?ORF-R為引物對，PCR得到木酮糖激酶基因片段；以pTPI1-F和pTPI1-R為引物對，PCR得到磷酸丙糖異構酶啟動子片段；以tTPI1-F和tTPI1-R為引物對，PCR得到磷酸丙糖異構酶終止子片段；以pHXT7-F和pHXT7-R為引物對，PCR得到葡萄糖轉運蛋白HXT7的啟動子片段；

(4)重組載體的構建

I、釀酒酵母整合型表達載體YIplac211-dpXKS的構建

用BamHI-KpnI酶切磷酸甘油激酶啟動子片段，連入YIplac211的BamHI-KpnI切口，得到質粒YIplac211-Pp；接著用KpnI-EcoRI酶切木酮糖激酶啟動子片段，連入YIplac211-Pp的KpnI-EcoRI切口，得到質粒YIplac211-dp；用SalI-BamHI酶切木酮糖激酶基因片段，連入YIplac211-dp的SalI-BamHI切口，得到質粒YIplac211-dpXKS；

II、質粒pOJ04的構建

以步驟(2)①得到的cDNA為模板，以xyl1-F和xyl1-R為引物對，擴增得到xyl1基因；以步驟(2)①得到的cDNA為模板，以xyl2-F和xyl2-R為引物對，擴增得到xyl2基因；用SpeI-EcoRI酶切上一步驟得到的磷酸丙糖異構酶啟動子片段，連入pYES2的SpeI-EcoRI切口，得到質粒pOJ01；將xyl1基因和上一步驟得到的磷酸丙糖異構酶終止子片段等摩爾比混合后作為模板，使用引物對xyl1-F+tTPI1-R擴增得到XYL1-tTPI1；將xyl2基因和上一步驟得到的葡萄糖轉運蛋白HXT7啟動子片段等摩爾比混合后作為模板，使用引物對pHXT7-F+xyl2-R擴增得到pHXT7-XYL2；XYL1-tTPI1和pHXT7-XYL2經純化后，以之作為模板再次進行融合PCR，使用引物對xyl1-F+xyl2-R，得到4片段的融合產物XYL1-t-p-2；XYL1-t-p-2用EcoRI-XbaI酶切，連入pOJ01的EcoRI-XbaI切口，得到質粒pOJ04；

(5)木酮糖激酶過表達的釀酒酵母菌的制備

將線性化的YIplac211-dpXKS轉化入釀酒酵母感受態細胞，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省卻培養基選擇性平板，30℃倒置培養；使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R通過菌落PCR篩選得到陽性克??；將陽性克隆涂布于含有5-FOA的篩選平板上，使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R再次篩選pPGK1正確插入到XKS?ORF之前的轉化子，得到木酮糖激酶過表達的釀酒酵母菌；

(6)表達木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因的釀酒酵母重組菌株的獲得

將木酮糖激酶過表達的釀酒酵母菌處理成感受態細胞；接著將線性化的pOJ04轉化入木酮糖激酶過表達的釀酒酵母菌感受態細胞中，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省卻培養基選擇性平板，30℃倒置培養，使用引物xyl1-F和xyl1-R進行菌落PCR，篩選出表達木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因的釀酒酵母重組菌株。