[發明專利]一種產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410586237.2
• 申請日: 2014-10-20
• 公開（公告）號: CN104328177A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 敬曉棋;黃光東;張瓊;陳生葉;李復煌;高世宏;高天宏;陳立強
• 申請（專利權）人: 陜西溯源農業發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/145
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒。

背景技術

產氣莢膜梭菌病是由產氣莢膜梭菌引起的一種人畜共患急性傳染病，該菌廣泛分布于自然界，也是動物腸道中的常在菌之一。產氣莢膜梭菌能產生多種外毒素，對豬、牛、羊、雞、兔、犬、人等多種動物具有致病性，導致壞死性腸炎、腸毒血癥是該菌感染的典型特征。產氣莢膜梭菌感染引起的動物猝死癥，一般發病快、病程短、死亡率極高，往往來不及治療，對養殖業發展和人類健康造成嚴重威脅。

牛猝死癥是由產氣莢膜梭菌A型菌導致的，也有C、D型菌致病。國外報道的是以C、D型菌導致牛的壞死性腸炎或腸原性毒血癥較多。病牛主要表現為病初厭食、精神不振、不愿走動、體溫升高、鼻鏡干燥、呼吸困難、心跳加快隨后表現不安、腹痛、排稀糊狀帶血的腥臭糞便，最后口吐白沫，倒地痙攣而死。

兔腸毒血癥是由產氣莢膜梭菌是由A型或E型菌引起的腸毒血癥，多發于斷奶后至成年的家兔。臨診癥狀為病兔精神沉郁，但體溫不高，食欲不佳或絕食，病初糞便變形變稀，很快排帶血、膠凍樣或黑色水樣糞便，急劇腹瀉，個別病例雖經藥物治療可停止水瀉，但死亡率高達100％。

A型菌和C型產氣莢膜梭菌引起的雞散發性腸黏膜壞死時，最急性者突然發病迅速衰弱死亡，看不到明顯癥狀；急性感染雞精神沉郁、羽毛蓬亂、胸骨著地、食欲減弱、排帶血糞便。多數。多數病雞冠瞼青紫，少數呈蒼白色，致死率高；輕癥病例表現一般中毒癥狀2～3d后逐漸好轉，隨食欲增加而康復。

C型產氣莢膜梭菌引起豬猝死癥多見于3日齡仔豬，表現為紅色血便，也稱作仔豬。病豬體質虛弱、排出含組織碎片的紅褐色稀糞，死亡率在12％，10齡后部分仔豬出現白痢，后逐漸恢復正常。少數病豬沒有下血痢便昏倒和死亡。

羊猝疽、羊腸毒血癥、羔羊痢疾分別是由產氣莢膜梭菌C、D、B型菌引起的。羊猝疽以潰瘍性腸炎和腹膜炎為特征，病羊掉群，臥底，表現不安，衰弱、痙攣、眼球突出、腹腔、胸腔、心包大量積水，在數小時死亡；羊腸毒血癥病羊在倒斃前，四肢出現強烈的劃動，肌肉震顫，眼球轉動，磨牙，口水較多隨后顯著抽搐，往往死于2-4小時死亡，上下頜咯咯作響，繼而昏迷，靜靜死去；羔羊痢疾主要表現為強烈腹瀉，精神差糞便惡臭，頭向后仰，體溫降低，小腸發生潰瘍和血液，心包積液，肺充血、淤血；

產氣莢膜梭菌的致病性與其分泌的外毒素有關，目前已發現12種外毒素，其中起主要致病作用的為α、β、ε、ι4種，根據這4種毒素將該菌分為A、B、C、D、E五中血清型。產氣莢膜梭菌A、B、C、D、E型均能產生α毒素，α毒素是人和動物氣性壞疽以及牛、馬、雞壞死性腸炎的主要致病因子。β毒素主要由B、C型菌產生，可引起反芻動物(以羊為主)患腸毒血癥，主要癥狀是嘔吐，血性腹瀉，甚至可引起腸梗阻和小腸壞死。ε毒素主要由B、D型菌產生，它主要引起羊腸毒血癥。只有E型菌能產生ι毒素，是一種皮膚壞死性和致命性毒素，是公認的引起羔羊、犢牛和家兔患腸毒血癥的主要毒素。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，本發明的試劑盒由一套設計的引物、10×LAMP反應液(10倍環介導等溫擴增反應液)、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成。采用本發明可以定性檢測豬、牛、羊、雞、人等多種動物的產氣莢膜梭菌感染。本發明利用Bst?DNA酶的鏈置換特性，設計4條引物，識別靶序列的6個區域，在等溫條件下生成大量重復的莖環狀結構，在定性檢測時不需任何特殊設備，只需眼觀反應管道顏色變化即可判定，因此具有特異性、敏感性高和檢測時間比普通PCR短、適用于養殖場現場的快速檢測等特點。本發明的目的具體體現在以下幾個方面：

1.常規PCR檢測技術相比本技術速度慢，從采樣到出結果最少需要48h，本技術僅需30-90分鐘；

2.常規PCR需要需要PCR儀、電泳系統、凝膠成像系統等大型、昂貴的儀器設備本技術僅需要一個恒溫箱或保溫杯即可；

3.常規PCR的結果必須在凝膠成像儀下觀察，本技術的試劑盒反應完畢后肉眼即可判定結果；

4.本試劑盒檢測的敏感性、特異性比常規PCR更高。

其具體技術方案為：

一種產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，

由一套引物、10倍環介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對引物和一對內引物組成，其序列為：