[發明專利]一種產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410586237.2
• 申請日: 2014-10-20
• 公開（公告）號: CN104328177A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 敬曉棋;黃光東;張瓊;陳生葉;李復煌;高世宏;高天宏;陳立強
• 申請（專利權）人: 陜西溯源農業發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/145
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，其特征在于，

由一套引物、10倍環介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對引物和一對內引物組成，其序列為：

引物1：AGAGAACATGCATGAGCT

引物2：CTCTCCAAGATAGAATGTAGCT

內引物1：TCTGTATCAGGATCCCAGAAATGATACTTATCCAGATTATGATAAGAACG

內引物2：ATACCTGACACAGGGGAATCACTTTGCCATTCATATCTAGCT

其中，所述的一對引物與一對內引物的摩爾數之比為1∶6～9；所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst?DNA聚合酶，活力為8個活性單位/微升；所述的陽性對照為含有插入產氣莢膜梭菌α毒素基因一段特異序列的陽性質粒，環介導等溫擴增反應擴增區位于該特異序列中，其濃度為10⁷拷貝/μL；所述的陰性對照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR?Green?I。

2.根據權利要求1所述的產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的10倍環介導等溫擴增反應液是由200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、40～100mmol/L硫酸鎂、4～10mol/L甜菜堿、5～18mmol/L的dNTPs、和質量百分濃度0.1％的Triton?X-100組成。

3.根據權利要求2所述的產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。

4.根據權利要求1所述的產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性質粒的制作方法為：采用PCR擴增一段產氣莢膜梭菌α毒素基因特異序列，然后裝入PMD18-T載體，轉化至DH5α感受態細菌，抽取質粒DNA經序列確定后，采用紫外分光光度計測定質粒DNA的濃度并用滅菌雙蒸水調整拷貝數至10⁷拷貝/μL。

5.根據權利要求1所述的產氣莢膜梭菌等溫PCR現場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的SYBR?Green?I為高靈敏度的DNA熒光染料。