[發(fā)明專利]一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410586237.2 | 申請日： | 2014-10-20 |
| 公開（公告）號： | CN104328177A | 公開（公告）日： | 2015-02-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 敬曉棋;黃光東;張瓊;陳生葉;李復(fù)煌;高世宏;高天宏;陳立強(qiáng) | 申請（專利權(quán)）人： | 陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/145 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 710000 陜西省西安市經(jīng)濟(jì)*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 莢膜 等溫 pcr 現(xiàn)場 快速 檢測 試劑盒 | ||
1.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，
由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對引物和一對內(nèi)引物組成，其序列為：
引物1：AGAGAACATGCATGAGCT
引物2：CTCTCCAAGATAGAATGTAGCT
內(nèi)引物1：TCTGTATCAGGATCCCAGAAATGATACTTATCCAGATTATGATAAGAACG
內(nèi)引物2：ATACCTGACACAGGGGAATCACTTTGCCATTCATATCTAGCT
其中，所述的一對引物與一對內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1∶6～9；所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst?DNA聚合酶，活力為8個(gè)活性單位/微升；所述的陽性對照為含有插入產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因一段特異序列的陽性質(zhì)粒，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序列中，其濃度為107拷貝/μL；所述的陰性對照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR?Green?I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液是由200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、40～100mmol/L硫酸鎂、4～10mol/L甜菜堿、5～18mmol/L的dNTPs、和質(zhì)量百分濃度0.1％的Triton?X-100組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性質(zhì)粒的制作方法為：采用PCR擴(kuò)增一段產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因特異序列，然后裝入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，抽取質(zhì)粒DNA經(jīng)序列確定后，采用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒DNA的濃度并用滅菌雙蒸水調(diào)整拷貝數(shù)至107拷貝/μL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的SYBR?Green?I為高靈敏度的DNA熒光染料。
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