[發明專利]一種高特異性14個位點多個耳聾易感基因的多重PCR-LDR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410586158.1
• 申請日: 2014-10-28
• 公開（公告）號: CN104313159A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 步迅;張全芳;劉艷艷
• 申請（專利權）人: 步迅
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種同時檢測14個耳聾易感基因的PCR-LDR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括包裝盒體(1)，PCR擴增試劑(2)，LDR連接反應試劑(3)，基因分型試劑(4)，質控品(5)；

所述PCR擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl₂，dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8對引物混合物以及超純水；

所述LDR連接反應試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測探針混合物，DNA連接酶，10X緩沖液及超純水；

所述基因分型試劑包括：ROX-300內標，用于基因分型的14個耳聾基因突變位點對應的基因分型標準物；

所述質控品包括：陰性質控品為滅菌的雙蒸水，野生型質控品為經測序鑒定14個位點均為野生型的基因組DNA，陽性質控品為GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191?del?16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226?G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，線粒體12SrDNA：1555A＞G/1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共計14個耳聾易感基因位點的突變質粒；

使用所述的試劑盒進行復合PCR擴增反應的條件：PCR擴增體系的PH值為8.3-8.9，鎂離子濃度為1.5-3mM，4種dNTP的終濃度為200-300uM，Taq酶的用量為0.5-1U，8對引物混合物中單對引物終濃度為0.5-5uM，LDR探針混合物中，通用探針終濃度0.1-0.5uM，14組檢測探針終濃度為1-5uM；

使用所述試劑盒進行LDR-PCR反應時，擴增階段反應及LDR連接反應分別在一個復合體系中進行，同時擴增連接GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191?del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，線粒體12SrDNA：1555A＞G/1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共計14個耳聾易感基因位點；

所述試劑盒中包括PCR復合擴增使用8對引物，LDR復合體系使用16組探針，其中包括2組通用探針，14組檢測探針；

用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191del16?3個基因位點檢測的上下游引物目的片段長度為1136bp，其序列分別為：

SEQ?NO.1：G2F.GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT

SEQ?NO.2：G2R.GAATCTATGTGTTGGGATATGGT

用于IVS7-2A＞G位點檢測的上下游引物目的片段長度為450bp，其序列分別為：

SEQ?NO.3：IVS7-2F，CACTGCTGGATTGCTCTC

SEQ?NO.4：IVS7-2R.CAAATGGCTTGACGTTTGT

用于2168A＞G位點檢測的上下游引物目的片段長度為700bp，其序列分別為：

SEQ?NO.5：2168F，ATCACTTGAACTTGGGACAC

SEQ?NO.6：2168R.CTGGGCTTCTTTGTGGCCT

用于1226G＞A、1174A＞T位點檢測的上下游引物目的片段長度為885bp，其序列分別為：

SEQ?NO.7：1226-1174F，GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA

SEQ?NO.8：1226-1174R，GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG

用于1975G＞C、2027T＞A位點檢測的上下游引物目的片段長度為287bp，其序列分別為：

SEQ?NO.9：1975-2027F，TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA

SEQ?NO.10：1975-2027R，ATTGCCAAAGCTCCAAACGT

用于線粒體12SrDNA基因1555A＞G、1494C＞T位點檢測的上下游引物目的片段長度為923bp，其序列分別為：

SEQ?NO.11：M-F，gataccccactatgcttagccctaa

SEQ?NO.12：M-R.ggtaggtttgtcgcctctacctataa

用于GJB3基因538C＞T位點檢測的上下游引物目的片段長度為600bp，其序列分別為：

SEQ?NO.13：GJB3F，CGTGTGGGGGGATGAGCAG

SEQ?NO.14：GJB3R，GCAGCGGCAGGTGGAAGC

用于WSF1基因2158A＞G、2596G＞A位點檢測的上下游引物目的片段長度為671bp，其序列分別為：

SEQ?NO.15：WSF1F，CTGACCTGGCAGCAGTATCG

SEQ?NO.16：WSF1R，AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC

所述試劑盒使用16組LDR探針，其中包括2組通用探針，14組檢測探針

LDR通用模板1：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

通用熒光探針1：P-GCATCACTCAGAGGG-FAM

LDR通用模板2：GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT

通用熒光探針2：P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX

176-191?del16檢測探針序列為：

GJB2_176_M：P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC

GJB2_176_del：TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA

GJB2_176_NOdel：TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC

235delC位點檢測探針序列為

GJB2_235_M：P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC

GJB2_235_delC：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA

GJB2_235_C：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG

299-230delAT位點檢測探針序列為

GJB2_299_M：P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC

GJB2_299_delAT：TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC

GJB2_299_AT：TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT

用于SLC26A4基因1975G＞C的檢測探針序列為：

1975_M：P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC

1975_C：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG

1975_G：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC

用于SLC26A4基因2027T＞A的檢測探針序列為

2027_M：P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC

2027_T：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA

2027_A：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT

用于SLC26A4基因1174A＞T的檢測探針序列為：

1174_M：P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC

1174_A：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT

1174_T：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA

用于SLC26A4基因1226G＞A的檢測探針序列為：

1226_M：P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC

1226_G：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC

1226_A：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT

用于SLC26A4基因IVS7-2A＞G的檢測探針序列為：

IVS7-2_M：P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC

IVS7-2_A：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT

IVS7-2_G：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC

用于SLC26A4基因2168A＞G的檢測探針序列為：

2168_M：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC

2168?A：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT

2168_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC

用于12srRNA基因的1494C＞T的的檢測探針序列為：

1494_M：P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC

1494_C：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG

1494_T：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA

用于12srRNA基因的1555G＞A的的檢測探針序列為：

1555_M：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC

1555_G：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG

1555_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT

用于GJB3基因的538C＞T的檢測位點的探針序列如下：

538_M：P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC

538_C：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG

538_T：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA

用于WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A，2個檢測位點的探針序列分別為：

2158_M：P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC

2158_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT

2158_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC

2596_M：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC

2596_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC

2596_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT

所述16組探針，其中2條通用探針5’端需進行磷酸化修飾，3’端進行熒光染料標記，所用的熒光染料為不同的熒光素。