[發(fā)明專(zhuān)利]一種耳聾易感基因突變檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410583806.8
• 申請(qǐng)日: 2014-10-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104263848A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃秋英;李慶閣;王旭東
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廈門(mén)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12M1/00
• 代理公司: 廈門(mén)南強(qiáng)之路專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因突變檢測(cè)，尤其是涉及一種耳聾易感基因突變檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，目前已知的遺傳性疾病有4000多種，包括地中海貧血、先天愚型、耳聾等。其中，耳聾是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病，是交流障礙最常見(jiàn)的病因。在所有致聾因素中，遺傳因素是導(dǎo)致聾兒出生的主要原因，比例高達(dá)50％～60％，其具有較高的遺傳異質(zhì)性。另外，在大量的遲發(fā)性聽(tīng)力下降患者中，亦有許多患者是由于自身的基因缺陷所致，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對(duì)致聾環(huán)境因素易感性增加所致。

近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施與完成，大量與耳聾相關(guān)的基因被定位及克隆，耳聾基因檢測(cè)也隨之得以快速發(fā)展。迄今為止，與耳聾相關(guān)的基因座位有122個(gè)，其中僅有64個(gè)基因被克隆出來(lái)。耳聾易感基因的突變位點(diǎn)多樣化，且具有明顯的種族及區(qū)域差異，在不同國(guó)家或不同種族，甚至在同一國(guó)家的不同地區(qū)，其突變的類(lèi)型和頻率也存在較大差異。大量流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，GJB2、SLC26A4、線(xiàn)粒體12SrRNA以及GJB3基因是中國(guó)人群最常見(jiàn)的易感基因。這些基因在中國(guó)人群中的攜帶率高達(dá)5％～6％。由此可見(jiàn)，耳聾疾病的防控具有重要的優(yōu)生學(xué)意義。

目前耳聾篩查普遍采用的是傳統(tǒng)的物理學(xué)聽(tīng)力缺陷篩查方法，存在著確診時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(2年)和漏檢(尤其是遲發(fā)性耳聾)的缺陷，從而造成耳聾悲劇的不斷發(fā)生。耳聾的基因檢測(cè)能夠?qū)⒍@的發(fā)生由傳統(tǒng)的被動(dòng)治療轉(zhuǎn)向主動(dòng)預(yù)防，做到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，從而避免耳聾的發(fā)生，因此耳聾易感基因檢測(cè)有非常重要的意義。目前對(duì)耳聾易感基因進(jìn)行檢測(cè)的方法主要是基于PCR技術(shù)的一系列分子生物學(xué)方法，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)、等位特異性PCR、SNaPshot測(cè)序技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)、基因芯片以及DNA直接測(cè)序等，這些方法為耳聾易感基因的發(fā)現(xiàn)及鑒定做出了巨大的貢獻(xiàn)，但由于其耗時(shí)費(fèi)力，所需設(shè)備和耗材昂貴，尤其是難以同時(shí)對(duì)不同基因多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，一直未能被臨床廣泛接受。同時(shí)，我國(guó)分子診斷市場(chǎng)近年來(lái)也陸續(xù)出現(xiàn)了多種可用于臨床檢測(cè)的耳聾基因檢測(cè)試劑，其中最具影響力的是北京博奧生物技術(shù)有限公司開(kāi)發(fā)的可同時(shí)檢測(cè)上述4個(gè)耳聾相關(guān)基因中的9個(gè)國(guó)人熱點(diǎn)突變的遺傳性耳聾基因診斷芯片。該產(chǎn)品將等位基因特異性引物延伸PCR與通用芯片相結(jié)合，可以達(dá)到靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)的目的，但因其儀器設(shè)備昂貴，且操作步驟多、需要PCR后處理、檢測(cè)位點(diǎn)較少，使其無(wú)法更好地滿(mǎn)足臨床耳聾基因診斷的需求。此外，也有國(guó)內(nèi)其他企業(yè)開(kāi)發(fā)針對(duì)個(gè)別位點(diǎn)的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)試劑，這些試劑針對(duì)性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，適合特殊位點(diǎn)的快速檢測(cè)，但是顯然不適合作為篩查目的使用。由此可見(jiàn)，目前我國(guó)尚缺乏一種操作簡(jiǎn)便、成本低、檢測(cè)基因數(shù)目多、覆蓋突變位點(diǎn)全面的遺傳性耳聾高通量篩查試劑，這也極大制約了耳聾疾病的防控。

熔解曲線(xiàn)(Dissociation?Curve)是指隨溫度升高反映DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈的曲線(xiàn)。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈一半的溫度稱(chēng)為熔解溫度，即熔點(diǎn)(T_m)，熔點(diǎn)是雙鏈DNA固有的屬性，不同序列的雙鏈DNA，其T_m值不同，這與雙鏈DNA的序列長(zhǎng)度、堿基組成相關(guān)。在實(shí)時(shí)PCR(Real-time?PCR)技術(shù)推出來(lái)之后，熔解曲線(xiàn)技術(shù)常用來(lái)分析基于熒光染料的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的特異性，根據(jù)PCR產(chǎn)物的T_m值的大小判定產(chǎn)物是目標(biāo)產(chǎn)物還是非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，儀器設(shè)備分辨率的改進(jìn)，目前基于熒光染料的熔解曲線(xiàn)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成的高分辨熔解曲線(xiàn)(High?Resolution?Melting?Curve)技術(shù)，該技術(shù)可以識(shí)別單個(gè)堿基的突變，Chen等人(Neng?Chen,etc.Mutation?Analysis?of?SLC26A4for?Pendred?Syndrome?and?Nonsyndromic?Hearing?Loss?by?High-Resolution?Melting.The?Journal?of?Molecular?Diagnostics,2011,13:416-426.)將該技術(shù)用于SLC26A4基因突變的快速檢測(cè)，但由于該技術(shù)本身的局限性，只能對(duì)基因突變進(jìn)行掃描，同時(shí)需要對(duì)突變樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以確定突變的類(lèi)型，且對(duì)DNA樣本質(zhì)量要求非常高，不太適合在各臨床實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容