[發(fā)明專利]一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410583352.4
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104357539B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周景文;陳堅;曾偉主;李江華;堵國成
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循環(huán)中一個關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，是氨基酸和蛋白質(zhì)代謝過程中主要的前提物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域。但低生產(chǎn)效率這一缺陷嚴(yán)重地限制了發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸在工業(yè)上的發(fā)展和應(yīng)用，因此，對α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株的篩選迫在眉睫。

目前，有機(jī)酸的檢測一般使用氣相色譜法或者HPLC法，用此方法來篩選菌株存在繁瑣、效率低等缺點。還沒有關(guān)于高通量篩選α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株方面的相關(guān)報道。

本發(fā)明通過利用有機(jī)酸生產(chǎn)過程中pH變化這一特性，結(jié)合pH指示劑和高通量技術(shù)建立了高效、快速篩選有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，是先將待篩選菌株于含有變色范圍包含了pH 2.6～5.2中的任一pH值的pH指示劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，選取變色圈較大的菌株于高通量孔板中發(fā)酵后，再加入變色范圍包含了pH 1.4～3.2中的任一pH值的pH指示劑進(jìn)行復(fù)篩，選取變色較大的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗證。

所述方法，是先用含有溴甲酚綠或百里酚藍(lán)或剛果紅的培養(yǎng)基對待篩選菌株進(jìn)行初篩，挑選變色圈較大的菌落，于高通量孔板中發(fā)酵后，取發(fā)酵液上清，加入喹哪啶紅或橙黃ⅣpH指示劑，進(jìn)行復(fù)篩，選取變色較大的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗證。

所述有機(jī)酸可以是以下任意一種：檸檬酸、異檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、苯丙酮酸、a-酮異己酸、延胡索酸、脂肪酸、草酰乙酸。

所述有機(jī)酸在本發(fā)明的一種實施方式中是α-酮戊二酸。

所述溴甲酚綠或百里酚藍(lán)或剛果紅，在培養(yǎng)基中的添加量為常規(guī)添加量。

所述溴甲酚綠指示劑的配制方法：溴甲酚綠0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液2.8ml使溶解，再加水稀釋至200ml，變色范圍pH 3.6～5.2。

所述溴甲酚綠，在本發(fā)明的一種實施方式中，是直接在培養(yǎng)基中加入終濃度在0.2-0.5g/L的固體溴甲酚綠。在高產(chǎn)有機(jī)酸菌株的培養(yǎng)基中，溴甲酚綠變色明顯，而且對細(xì)胞沒有毒害作用。

所述初篩，可以是將菌株點種、涂布或者劃線在平板上。

所述高通量孔板可以是96深孔板、96淺孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一種具有高通量篩選作用的培養(yǎng)器皿。

所述喹哪啶紅pH指示劑的配制方法：取喹哪啶紅0.1g，加甲醇100ml使溶解，即得。變色范圍pH1.4～3.2(無色→紅)。

所述加入喹哪啶紅pH指示劑的量，為上清體積1/25至1/100。

所述加入橙黃ⅣpH指示劑的量，為上清體積1/50至1/200。

所述加入喹哪啶紅或橙黃ⅣpH指示劑后，反應(yīng)5—60min。

所述加入喹哪啶紅pH指示劑的量，在本發(fā)明的一種實施方式中，為上清體積的1/50。

所述加入橙黃ⅣpH指示劑的量，在本發(fā)明的一種實施方式中，為上清體積的1/200。

所述上清，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將發(fā)酵液離心后獲得的。

所述復(fù)篩，在本發(fā)明的一種實施方式，還可以是加入喹哪啶紅pH指示劑后，測定OD₅₂₀，數(shù)值相對較小的即為復(fù)篩得到的菌株。

所述復(fù)篩，在本發(fā)明的一種實施方式，還可以是加入橙黃ⅣpH指示劑后，測定OD₅₂₀，數(shù)值相對較大的即為復(fù)篩得到的菌株。

本發(fā)明還提供一種利用所述高通量篩選方法來篩選α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株的方法，是先將待篩選菌株于含有溴甲酚綠的培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，挑取變色圈較大的菌落，再于高通量孔板中發(fā)酵后，取發(fā)酵液上清，加入喹哪啶紅pH指示劑，選取變色較大的菌株為復(fù)篩得到的菌株，對復(fù)篩得到菌株進(jìn)行發(fā)酵驗證，即得到α-酮戊二酸相對高產(chǎn)菌株。

所述菌株是任意一種：能生產(chǎn)有機(jī)酸的菌株。

所述高產(chǎn)菌株，在本發(fā)明的一種實施方式中，是在發(fā)酵過程中能使發(fā)酵液的pH能夠達(dá)到3.6以下的菌株。

所述菌株，在本發(fā)明的一種實施方式中，是解脂亞洛酵母Yarrowia lipolytica。

所述菌株，在本發(fā)明的一種實施方式中，是Yarrowia lipolytica CCTCC NO：M207143及其經(jīng)ARTP誘變后得到的菌株。