[發明專利]產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發酵工藝

無效

• 申請號: 201410583223.5
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104278006A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 高學軍;劉營;張雙;武彩霞;駱超超;婁麗;李學琳;潘洪寶;孫喆
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P13/08;C12P13/12;C12R1/07
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一種基因工程菌株的制備方法和發酵工藝。

背景技術

納豆芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌納豆菌亞種，革蘭陽性菌，好氧，有芽孢，極易成鏈。只具有單層細胞外膜，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。在極端的條件下，還可以誘導產生抗逆性很強的內源胞子。是各種益生菌當中，對環境耐受力最好可以直達小腸的菌種之一，口服后可改變動物腸道菌叢生態，幫助消化道機能正?；?。可以產酸，調節腸道菌群，增強動物細胞免疫反應。并能生成多種蛋白酶(特別是堿性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物，從而提高飼料的轉化率。

納豆芽孢桿菌是一種重要的飼用益生菌，其菌種及發酵產物能夠作為飼料添加劑提升畜禽乳肉蛋的產量和品質。在畜禽生產中，蛋氨酸和賴氨酸是最重要的氨基酸，是飼料成分中對畜禽生產最重要的影響因素，能有效地提高飼料蛋白轉化率。益生菌中蛋氨酸和賴氨酸含量較低，如能提高益生菌中蛋氨酸和賴氨酸的含量，將使益生菌營養更加豐富、更好地提高飼料蛋白轉化率，從而更有效地發揮益生菌的功用。但目前尚未建立提高益生菌蛋氨酸和賴氨酸含量的生物技術，致使益生菌未能最佳地發揮其提高飼料轉化率的功用，因而有必要建立提高益生菌蛋氨酸和賴氨酸含量的生物技術，形成更有價值的益生菌新一代產品。

發明內容

本發明是要解決現有益生菌中蛋氨酸和賴氨酸含量較低，未能有效提高飼料蛋白轉化率的技術問題，提供產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發酵工藝。

本發明產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，按以下步驟進行：

一、利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因Zein全長476bp片段；

二、利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因Cflr全長720bp片段；

三、利用枯草芽孢桿菌特異表達載體pHT43分別構建pHT43/Zein和pHT43/Cflr基因重組載體；

四、以納豆芽孢桿菌為出發菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質體，將重組載體pHT43/Zein轉入納豆芽孢桿菌原生質體，然后于轉化培養液中25℃培養24小時，然后收集菌體，涂布LB培養基平板，所述LB培養基平板中添加100μg/mL氨芐青霉素和5μg/mL氯霉素，進行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養基中進行液態培養，每管LB培養基中接種一個單菌落，于37℃培養24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Zein基因mRNA的含量，對熒光定量PCR的結果進行分析，選擇Zein基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測蛋氨酸的含量，檢測出蛋氨酸的重組菌為穩定表達高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌；

五、以步驟四獲得的穩定表達高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌為出發菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質體，然后將pHT43/Cflr轉入納豆芽孢桿菌原生質體，于轉化培養液中25℃培養24小時，然后收集菌體，涂布LB培養基平板，所述LB培養基平板中添加100μg/mL氨芐青霉素和5μg/mL氯霉素，進行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養基中進行液態培養，每管LB培養基中接種一個單菌落，于37℃培養24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Cflr基因mRNA的含量，對熒光定量PCR的結果進行分析，選擇Cflr基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測賴氨酸的含量，檢測出賴氨酸的重組菌為穩定表達高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納豆芽孢桿菌；

步驟四和步驟五中轉化培養液配方：每升轉化培養液含5gK₂HPO₄、6gKH₂PO₄、2gNa₂SO₄、1g檸檬酸鈉、0.2gMgSO₄、0.05gCaCl₂、0.005gFeCl₃、0.001gMnSO₄、80mg色氨酸，5g葡萄糖和2g谷氨酸鈉，pH7.5。

步驟四熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：

上游引物：5’-GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3’，

下游引物：5’-GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3’；

步驟四熒光定量PCR中檢測Zein基因的引物序列為：

上游引物：5’-CCGTCTCGCAGATTAT-3’，