[發明專利]產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發酵工藝

無效

• 申請號: 201410583223.5
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104278006A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 高學軍;劉營;張雙;武彩霞;駱超超;婁麗;李學琳;潘洪寶;孫喆
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P13/08;C12P13/12;C12R1/07
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

1.產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進行：

一、利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因Zein全長476bp片段；

二、利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因Cflr全長720bp片段；

三、利用枯草芽孢桿菌特異表達載體pHT43分別構建pHT43/Zein和pHT43/Cflr基因重組載體；

四、以納豆芽孢桿菌為出發菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質體，將重組載體pHT43/Zein轉入納豆芽孢桿菌原生質體，然后于轉化培養液中25℃培養24小時，然后收集菌體，涂布LB培養基平板，所述LB培養基平板中添加100μg/mL氨芐青霉素和5μg/mL氯霉素，進行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養基中進行液態培養，每管LB培養基中接種一個單菌落，于37℃培養24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Zein基因mRNA的含量，對熒光定量PCR的結果進行分析，選擇Zein基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測蛋氨酸的含量，檢測出蛋氨酸的重組菌為穩定表達高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌；

五、以步驟四獲得的穩定表達高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌為出發菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質體，然后將pHT43/Cflr轉入納豆芽孢桿菌原生質體，于轉化培養液中25℃培養24小時，然后收集菌體，涂布LB培養基平板，所述LB培養基平板中添加100μg/mL氨芐青霉素和5μg/mL氯霉素，進行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養基中進行液態培養，每管LB培養基中接種一個單菌落，于37℃培養24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Cflr基因mRNA的含量，對熒光定量PCR的結果進行分析，選擇Cflr基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測賴氨酸的含量，檢測出賴氨酸的重組菌為穩定表達高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納豆芽孢桿菌；

步驟四和步驟五中熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：

上游引物：5’-GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3’，

下游引物：5’-GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3’；

步驟四熒光定量PCR中檢測Zein基因的引物序列為：

上游引物：5’-CCGTCTCGCAGATTAT-3’，

下游引物：5’-GCAGCACCAACAAAGG-3’；

步驟五熒光定量PCR中檢測Cflr基因的引物序列為：

上游引物：5’-GAAAGAAATGGTGGGAC-3’，

下游引物：5’-CTACAGCAGCAACAGC-3’。

2.根據權利要求1所述的產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于步驟一中PCR引物為：F1：5’-GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3’，R1：5’-TCCCCCGGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3’，PCR反應條件為：94℃預變性1min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，72℃再延伸10min。

3.根據權利要求1所述的產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于步驟二中PCR引物為：F2：5’-GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3’，R2：5’-TCCCCCGGGTAAACTAATAAATAGCCCTCTTCCC-3’，PCR循環反應條件為94℃預變性30s，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共30個循環，72℃再延伸10min。

4.根據權利要求1所述的產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于步驟三中pHT43/Zein的構建方法為：用XbaI和SmaI分別對基因Zein和載體pHT43進行雙酶切，然后連接酶切產物，獲得重組載體pHT43/Zein。

5.根據權利要求1所述的產蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于步驟三中pHT43/Cflr的構建方法為：用XbaI和SmaI分別對基因Cflr和載體pHT43進行雙酶切，然后連接酶切產物，獲得重組載體pHT43/Cflr。