[發明專利]金線蓮種子與真菌共生萌發快速成苗的方法

有效

• 申請號: 201410582811.7
• 申請日: 2014-10-28
• 公開（公告）號: CN104350838A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 趙有林;崔保登
• 申請（專利權）人: 桂林保林生物技術有限公司
• 主分類號: A01C1/02
• 分類號: A01C1/02;A01G1/04
• 代理公司: 桂林市華杰專利商標事務所有限責任公司 45112
• 代理人: 楊雪梅

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體來說是金線蓮種子與真菌共生萌發快速成苗的方法。?

背景技術

?金線蓮為地生蘭，種子細微，比毛發還細小，不具胚乳，無發芽能力，只有在真菌共生下，才促進種子萌發生長,但其發芽率很低。而金線蓮對生態環境要求也極為嚴苛，多生長在常綠闊葉林的溝邊，小溪邊的土質松散，陰涼潮濕地帶，所以野生金線蓮的成苗率就更低，或為萬分之一。由于金線蓮的自然繁殖率極低，生態環境的嚴重破壞，以及人為的盲目采挖，野生金線蓮已經日趨枯竭，瀕臨滅絕。近年來，國內外研究人員紛紛加強對金線蓮的藥用價值開發力度，金線蓮中許多具備藥理活性成分的化合物不斷地被發現與驗證，金線蓮的藥用價值和保健功能為越來越多的人們所認知，市場需求越來越大。?

現有蘭科植物的繁育模式—組培工廠(金線蓮莖段為外植體無菌組培和金線蓮種子無菌播種)繁育金線蓮，雖然可以繁育大量的金線蓮組培苗，但存在著許多不足：首先，育苗工藝繁瑣，需要配制3或4種培養基質，原球莖需要轉接3次或4次。其次，育苗的生產成本較高，需要無菌的工作環境；育苗周期較長，至少需要110-120天的培育時間，甚至更長的培育周期。?

金線蓮組培苗從無菌的環境移栽到自然的生長環境，導致生長緩慢、植株抗病力低、有效藥用成分達不到要求，對金線蓮的藥用價值開發形成制約。?

在自然界中，整個蘭科植物的生活史都與共生真菌緊密聯系著，共生真菌促進蘭科植物種子萌發，為萌發的原球莖提供營養物質，促進其轉化成幼苗成長。?

研究金線蓮種子與共生真菌共生萌發快速成苗的方法，是完全模擬蘭科植物在自然界中的自然生長規律，發現金線蓮種子與共生真菌背后的共生規律，實現從金線蓮種子與真菌共生萌發的有性繁育和快速成苗，這一種繁育模式具有成苗周期短，僅需70—90天；成苗抗病力和抗逆性強；金線蓮成苗的有效藥用成分接近野生金線蓮。這一由金線蓮種子和真菌共生萌發快速繁育金線蓮幼苗的生產模式，可為其它珍稀蘭科植物品種的保育開辟一個全新的高效繁育模式。?

目前，國內外能夠把真菌的共生技術運用在蘭科植物的有性繁育和人工規模化栽培品種是天麻，由上世紀80年代徐錦堂研發而成。此后，國內外的許多蘭科真菌研究專家學者對其它蘭科植物的共生真菌、真菌與蘭科植物種子共生機理作了深入全面的理論研究和實踐運用，但是還沒有能夠實現從蘭科植物種子和真菌共生萌發、萌發的原球莖繼續成長發育成幼苗規模化栽培這一關鍵階段技術的突破。?

發明內容

本發明的目的是提供一種金線蓮種子與真菌共生萌發快速成苗的方法，是全國首創的培育仿野生金線蓮與真菌共生成苗的快速生長模式。?

實現本發明目的的技術方案是：?

金線蓮種子與真菌共生萌發快速成苗的方法，包括如下步驟，

（1）金線蓮共生萌發真菌的分離、純化：

選取野生金線蓮健壯幼苗根狀莖的頂端突起部位、或是根狀莖的節上突起部位；將這一部位用70%酒精表面消毒3-5s，置于清水瓊脂培養基中培養、分離、純化；

（2）制備金線蓮共生萌發真菌的液體菌種：

將分離純化后的金線蓮有效共生萌發真菌—絲核菌（Rhizoctonia?sp.），保藏號為CGMCC?No.9728，從低溫保藏的斜面試管活化后，制備成液體共生菌種備用；

液體菌種的配制比例為：20%馬鈴薯提取液∶1—5%山毛櫸科樹葉提取液∶0.5—1.5%白砂糖；

所述山毛櫸科樹葉提取液的制備采用現有技術，具體是將山毛櫸科樹葉與水按1：5的比例混合，煮沸半小時，濾出原液制成；

（3）制備金線蓮共生萌發絲核菌的固體培養基：

培養基由山毛櫸科樹葉、山毛櫸科木屑、麥麩或米糠按照比例混合，再經過高溫殺菌，然后將絲核菌的液體菌種接種到培養基上，在溫度為25℃—27℃的環境下培養，待共生真菌長滿整個培養基，等待播種；

所述培養基原料配制的比例為：山毛櫸科樹葉30-45%∶山毛櫸科木屑30-45%∶米糠或麥麩10-40%，培養基的含水量為60—62%；

（4）金線蓮種子的播種與暗培養：

將成熟的金線蓮種子撒播在長滿共生真菌的培養基上，在溫度為25—27℃的環境下，暗培養45—60天，金線蓮種子與共生真菌共生萌發成長為粗壯的原球莖，原球莖長度達可達1.5-3cm；

（5）金線蓮原球莖的轉移與光培養：