[發明專利]日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法

在審

• 申請號: 201410582375.3
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104357559A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 孫軍;王素文
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

技術領域

本發明屬于生命醫學科學領域，尤其是涉及一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法。

背景技術

血吸蟲感染人體后，性成熟所導致的大量蟲卵的產生和釋放是造成血吸蟲病的根本原因。另外，現有藥物治愈血吸蟲病后，患者仍可因接觸疫水而再次感染，不具有免疫保護力。研究表明，活蟲在人體內可刺激人體產生抵御再次感染的免疫保護力，但是，活雌蟲本身會因性成熟產卵而致病。因此，目前急需建立一種方法能調節感染者體內血吸蟲發育，即使感染者長時間保持免疫力，但又不致于患病。研究發現，核糖體不僅是蛋白合成細胞器，同時又是蛋白表達調控者。尤其，在血吸蟲性成熟發育過程中，個性化核糖體裝配在雌蟲性成熟發育中發揮重要作用。分析和鑒定關鍵核糖體蛋白將為研發新的防治措施奠定基礎。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，通過Solexa和iTRAQ分析雌雄血吸蟲合抱前后基因表達譜和蛋白表達譜，并結合real-time?PCR和western技術驗證，可有效確定雌蟲發育調控中關鍵核糖體蛋白。該蛋白的鑒定將為通過影響蟲體核糖體功能為目的，以干預宿主體內蟲體發育并維持宿主伴隨免疫保護力的防治措施的研發提供關鍵依據。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)用血吸蟲尾蚴感染小鼠：包括單螺釋放單性尾蚴進行單性感染與多螺釋放混合尾蚴進行的雙性感染兩種方式；

(2)對感染后的小鼠在SPF級動物房飼養，飼養包括兩個階段四個時期，即單性感染18天和23天以及雙性感染18天和23天；

(3)收集培養后小鼠體內的日本血吸蟲：若單只小鼠僅獲得雌蟲，作為單性雌蟲樣本，若單只小鼠獲得兩性蟲體，分離雌蟲，作為雙性雌蟲樣本；

(4)將步驟(3)所得雌蟲轉移到Trizol試劑中，做solexa分析：分別分析不同雌蟲樣本基因表達譜，分析和比較不同樣本核糖體基因表達差異；

(5)將步驟(3)所得雌蟲轉移到生理鹽水中，做iTRAQ分析：分別分析不同雌蟲樣本核糖體蛋白表達譜，分析和比較不同樣本核糖體蛋白表達差異；

(6)通過對比不同發育階段核糖體蛋白表達譜和基因表達譜，得到雌蟲在不同發育階段，核糖體蛋白在蛋白和基因兩個水平的表達特點。

在步驟(4)做solexa分析后，用Real-time?PCR方法驗證solexa技術分析質量。

在步驟(5)做iTRAQ分析后，對其中高表達的蛋白進行Western?blot驗證。

步驟(1)中對小鼠進行感染時，利用單螺釋放單性尾蚴的特點，按一螺釋放的尾蚴感染一只小鼠，或者用不同螺釋放的血吸蟲尾蚴組合后感染小鼠。

對感染后的小鼠在SPF級動物房飼養18天時，血吸蟲為合抱前未發育的狀態，培養至23天時，為合抱后性成熟的狀態，取這兩個時間點的小鼠進行分析。

收集培養后小鼠體內的日本血吸蟲的方法為：用無菌預冷生理鹽水從小鼠主動脈灌注，沖出血吸蟲，然后將血吸蟲在無菌生理鹽水中洗3次。

做solexa分析之前，在解剖鏡下，用注射器針頭挑取并轉移新鮮雌蟲到含有1000ul?Trizol試劑的EPP管中，-80℃保存備用，或者直接勻漿取RNA。

做iTRAQ分析之前，在解剖鏡下，用注射器針頭挑取并轉移新鮮雌蟲到含有1000ul生理鹽水的EPP管中，液氮中保存備用。

由于不同發育階段的雌蟲可表達不同核糖體蛋白，裝配構成不同的核糖體，即個性化核糖體，以完成不同發育階段的特殊需求和功能。基于此分析，可獲得發育階段特異性表達的核糖體蛋白，這為針對性地選取不同核糖體蛋白進行旨在干預核糖體功能的深入研究提供了條件。因此，本發明方法的建立將核糖體裝配、蟲體發育階段以及階段特異性蛋白表達聯系起來，通過Solexa和iTRAQ分析雌雄血吸蟲合抱前后基因表達譜和蛋白表達譜，并結合real-time?PCR和western技術驗證，可有效確定雌蟲發育調控中關鍵核糖體蛋白。該蛋白的鑒定將為通過影響蟲體核糖體功能為目的，以干預宿主體內蟲體發育并維持宿主伴隨免疫保護力的防治措施的研發提供關鍵依據，為相近物種的相似研究和應用提供了依據。

附圖說明

圖1為日本血吸蟲單性和雙性感染發育18天(合抱前未發育)和23天(合抱后性成熟)時核糖體基因表達譜比較；