[發明專利]日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法

在審

• 申請號: 201410582375.3
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104357559A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 孫軍;王素文
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

1.一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)用血吸蟲尾蚴感染小鼠：包括單螺釋放的血吸蟲單性尾蚴進行的單性感染與多螺釋放的混合尾蚴進行的雙性感染兩種方式；

(2)對感染后的小鼠在SPF級動物房飼養，飼養包括兩個階段四個時期，即單性感染18天和23天以及雙性感染18天和23天；

(3)收集培養后小鼠體內的日本血吸蟲：若單只小鼠僅獲得雌蟲，作為單性雌蟲樣本，若單只小鼠獲得兩性蟲體，分離雌蟲，作為雙性雌蟲樣本；

(4)將步驟(3)所得雌蟲轉移到Trizol試劑中，做solexa分析：分別分析不同雌蟲樣本基因表達譜，分析和比較不同樣本核糖體基因表達差異；

(5)將步驟(3)所得雌蟲保存在生理鹽水中，做iTRAQ分析：分別分析不同雌蟲樣本核糖體蛋白表達譜，分析和比較不同樣本核糖體蛋白表達差異；

(6)通過對比不同發育階段核糖體蛋白表達譜和基因表達譜，得到雌蟲在不同發育階段，核糖體蛋白在蛋白和基因兩個水平的表達特點。

2.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，在步驟(4)做solexa分析后，用Real-time?PCR方法驗證solexa技術分析質量。

3.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，在步驟(5)做iTRAQ分析后，對其中高表達的蛋白進行Western?blot驗證。

4.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中對小鼠進行感染時，利用單螺釋放單性尾蚴的特點，按一螺釋放的尾蚴感染一只小鼠，或者用不同螺釋放的尾蚴組合后感染小鼠。

5.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，對感染后的小鼠在SPF級動物房飼養18天時，血吸蟲為合抱前未發育的狀態，培養至23天時，為合抱后性成熟的狀態，取這兩個時間點的小鼠進行分析。

6.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，收集培養后小鼠體內的日本血吸蟲的方法為：用無菌預冷生理鹽水從小鼠主動脈灌注，沖出血吸蟲，然后將血吸蟲在無菌生理鹽水中洗3次。

7.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，做solexa分析之前，在解剖鏡下，用注射器針頭挑取并轉移新鮮雌蟲到含有1000ul?Trizol試劑的EPP管中，-80℃保存備用，或者直接勻漿取RNA。

8.根據權利要求1所述的一種日本血吸蟲雌蟲發育調控關鍵核糖體蛋白的鑒定方法，其特征在于，做iTRAQ分析之前，在解剖鏡下，用注射器針頭挑取并轉移新鮮雌蟲到含有1000ul生理鹽水的EPP管中，液氮中保存備用。