[發明專利]一種篩選微藻積脂調控酶的方法

有效

• 申請號: 201410581886.3
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104374812A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 李玉芹;穆錦秀;陳迪;韓方欣;徐華;劉婷婷;劉飛
• 申請（專利權）人: 湘潭大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/62
• 代理公司: 湘潭市匯智專利事務所(普通合伙) 43108
• 代理人: 顏昌偉

技術領域

本發明屬于微藻生化分析領域，具體涉及一種篩選微藻積脂調控酶的方法。?

背景技術

微藻是極具潛力的生物柴油原料之一。矛盾的是，諸多能源微藻，如褐藻、綠藻、硅藻、鹽藻，其油脂積累效率并不理想，致使快速產油無法實現，微藻生物柴油因此成為“貴族”能源。如何提高微藻油脂產率一直是微藻生物柴油產業化的一大難題。目前，獲得積脂微藻的培養模式主要包括非生物環境介導的培養模式和與極端環境脅迫耦合的“多階段”培養模式。?

非生物環境介導的培養模式可誘導藻細胞油脂高效富集，是提高油脂含量的有效途徑。華南理工大學呂等通過高鹽脅迫極地雪藻獲得了較正常條件下高達68倍的油質藻細胞。Takagi等將杜氏鹽藻以1M?NaCl脅迫誘導，較無鹽脅迫條件下藻細胞油脂和甘油三酯含量分別提高70.6％和34.5％，而生物產量僅為0.68g/L。此外，盡管營養限制誘導胞內油脂積累的具體機制尚不明確，但其易控性好，因而對其研究較多。中國農大楊金水課題組、中國科學技術大學儲等考察了氮饑餓等特殊環境脅迫微藻積累油脂，成功獲得了高油脂含量的藻細胞，有些藻種屬油脂含量甚至高達80％。但是，盡管非生物逆境在油脂積累過程中起正調控作用，卻也限制了細胞生長，影響總脂產量，無法滿足微藻油脂作為理想生物柴油原料的要求。?

與極端環境脅迫耦合的“多階段”培養模式可從整體上優化油脂產量。華東理工大學李元廣課題組的“異養-稀釋-光誘導”多階段培養模式使得微藻油脂產率高達89.89mg/L/d。盡管“多階段”培養模式能顯著提高微藻油脂產率，但與?Sheehan等提出的油脂產量最大理論值相比，尚存在較大差距。部分原因在于缺乏對能源微藻胞內油脂代謝與環境互作調控機制的認識。?

關于藻類油脂合成代謝研究相對較少，目前所掌握的成果也是基于對高等植物以及有限的藻種的研究。中科院袁振宏課題組、亞利桑那州立大學Li等研究發現氮饑餓、高光誘導等條件下微藻細胞內的淀粉、葉綠素、蛋白質等能量物質經一系列代謝途徑轉化為油脂存儲。美國內布拉斯加林肯大學Msanne等通過氮限制刺激誘導萊茵衣藻胞內油脂積累，當油脂含量增加時，葉綠素和蛋白質含量降低，包括一些核糖體多肽和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶均降低，說明葉綠素和蛋白質也可提供油脂合成所需碳和能量，這與布魯克黑文國家實驗室Fan等的研究結果一致。暗示微藻油脂富集與它種能量物質之間存在一定的代謝動態關系。中科院李等采用抑制消減雜交技術通過cDNA文庫篩選得到了響應氮饑餓脅迫積累油脂相關的上調和下調基因，通過其潛在的分子路徑得出醛糖異構酶、淀粉磷酸化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、二氫硫辛酰胺脫氫酶、甘油二酯激酶是微藻細胞油脂合成代謝途徑關鍵調控酶，分別參與糖酵解、丙酮酸和乙酰CoA生成、TAG合成代謝途徑，丙酮酸和乙酰CoA是整個代謝網絡的關鍵調控點，通過調控酶的表達水平證實油脂合成是由淀粉經糖酵解轉化而來。盡管植物細胞中調控油脂合成的酶可為藻細胞所借鑒，但藻細胞內調控油脂合成的關鍵酶特性不同于植物細胞，且植物或者微生物細胞油脂合成過程關鍵調控酶并非微藻細胞油脂合成的限速酶。例如，將調控酵母或者大腸桿菌油脂合成的乙酰輔酶A羧化酶于藻細胞內過高表達，并未導致油脂含量顯著的提高。與此同時，傳統篩選積脂標志物的方法為“一個藻株，兩個反差條件”，即通過對同種藻株施以兩種極端環境條件脅迫(如：高鹽脅迫與無鹽脅迫，氮富足與氮饑餓)來發現和鑒定油脂代謝調控點，該方法所甄選的油脂代謝調控酶?因藻種屬差異而不具普適性與指導意義。?

發明內容

本發明的目的是提供一種篩選微藻積脂調控酶的方法。?

本發明的技術方案為：?

一種篩選微藻積脂調控酶的方法，包括如下步驟：(1)建立實驗室人工模擬下的鹽環境，培養鹽敏感小球藻及耐鹽小球藻；(2)藻細胞全蛋白的熒光差異凝膠電泳蛋白組學分析；(3)藻細胞積脂關鍵調控酶的甄選與鑒定。?

上述的篩選微藻積脂調控酶的方法，所述實驗室人工模擬的鹽環境具體為：向基礎培養基中加入NaCl，使氯化鈉的質量分數達到3.5％(海水鹽濃度)，經滅菌、冷卻后，按培養基體積的1-10％接入藻細胞種子液，然后在28℃條件下培養12-72小時。?

上述的篩選微藻積脂調控酶的方法，所述鹽敏感小球藻為普通淡水小球藻，所述耐鹽小球藻為海水小球藻。?