[發(fā)明專利]一種篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410581886.3
• 申請(qǐng)日: 2014-10-27
• 公開（公告）號(hào): CN104374812A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李玉芹;穆錦秀;陳迪;韓方欣;徐華;劉婷婷;劉飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湘潭大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/26
• 分類號(hào): G01N27/26;G01N27/62
• 代理公司: 湘潭市匯智專利事務(wù)所(普通合伙) 43108
• 代理人: 顏昌偉

1.一種篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，包括如下步驟：(1)建立實(shí)驗(yàn)室人工模擬下的鹽環(huán)境，培養(yǎng)鹽敏感小球藻及耐鹽小球藻；(2)藻細(xì)胞全蛋白的熒光差異凝膠電泳蛋白組學(xué)分析；(3)藻細(xì)胞積脂關(guān)鍵調(diào)控酶的甄選與鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，所述實(shí)驗(yàn)室人工模擬的鹽環(huán)境具體為：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入NaCl，使氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3.5％，經(jīng)滅菌、冷卻后，按培養(yǎng)基體積的1-10％接入藻細(xì)胞種子液，然后在28℃條件下培養(yǎng)12-72小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，所述的鹽敏感小球藻為普通淡水小球藻，所述的耐鹽小球藻為海水小球藻。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體為：按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，Glucose10份、KH₂PO₄1.25份、Urea3份、MgSO₄·7H₂O1份、Na₂EDTA0.5份、H₃BO₃0.12份、CaCl₂0.84份、ZnSO₄·7H₂O0.88份、MnCl₂·4H₂O0.014份、Na₂ΜoO₄0.007份、CuSO₄·5H₂O0.016份、Co(NO₃)₂·6H₂O0.005份、FeSO₄·7H₂O0.05份、蒸餾水1000份，培養(yǎng)基pH6.1，115℃滅菌20min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，所述的藻細(xì)胞全蛋白的熒光差異凝膠電泳蛋白組學(xué)分析具體為：(a)藻細(xì)胞全蛋白提取、純化與定量：離心收集藻細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行裂解、超聲處理，然后破碎核酸，離心收集上清液蛋白，經(jīng)純化、過夜沉淀、自然干燥后獲得純蛋白質(zhì)團(tuán)塊，團(tuán)塊重溶后以紫外分光光度法測(cè)定其濃度；(b)蛋白質(zhì)熒光差異凝膠二維電泳分析：蛋白樣品經(jīng)pH調(diào)試、染色、一維等電聚焦、二維雙向SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝膠電泳)后，獲得蛋白凝膠片；(c)凝膠圖譜差異蛋白點(diǎn)分析：蛋白凝膠片經(jīng)掃描成像，然后采用計(jì)算機(jī)圖譜數(shù)字分析化法分析2D凝膠圖譜包括蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)、背景消除和點(diǎn)的匹配、蛋白點(diǎn)匹配和體積計(jì)算，篩選重復(fù)性高、差異表達(dá)2.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)或者新誘導(dǎo)、消失的有意義蛋白點(diǎn)；(d)差異蛋白質(zhì)譜鑒定：差異蛋白經(jīng)切膠、膠內(nèi)酶解、點(diǎn)靶上機(jī)、質(zhì)譜分析獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，再進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索：利用軟件flex?Analysis過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰，再利用MASCOT程序和搜索引擎實(shí)施NCBInr、SWISS-PROT及TrEMBL蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，尋找匹配蛋白，查詢其功能，明確蛋白身份。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，所述的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件為：1)肽質(zhì)量范圍：800-4000Da；2)表觀pI與表觀Mr的誤差范圍：無限制；3)一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量誤差范圍：50ppm；4)二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量誤差范圍：0.6Da；5)酶解片段不完全即遺漏酶切位點(diǎn):1個(gè)；6)物種來源:Chlorella?vulgaris；7)電荷：+1；8)同位素峰：monoisotopic；9)固定修飾：半胱氨酸碘乙酰胺化；10)可變修飾：蛋氨酸氧化。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選微藻積脂調(diào)控酶的方法，所述的藻細(xì)胞積脂關(guān)鍵調(diào)控酶的甄選與鑒定具體為：

將差異蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的NCBI-gi登錄號(hào)即不同組別差異蛋白登錄號(hào)，輸入http://www.pir.georgetown.edu/pirwww/search/batch.shtml網(wǎng)站，按照相關(guān)操作，采用GO富集分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜的定位及生物學(xué)功能；

采用Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes即KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異蛋白在生物體內(nèi)所參與的生物通道，確保每個(gè)生物通路中至少含有3個(gè)差異蛋白。登錄網(wǎng)站http://www.genome.jp，選擇物種Chlorella?vulgaris，選擇物種登錄號(hào)種類NCBI-gi，進(jìn)行具體通路分析；若KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站沒有Chlorella?vulgaris，則選擇該網(wǎng)站與之相近物種數(shù)據(jù)，將Chlorella?vulgaris差異蛋白登錄號(hào)匹配成與之相近物種蛋白登錄號(hào)，以％identity和％positives兩種參數(shù)衡量匹配度，選擇匹配相識(shí)度高大于80％的匹配登錄號(hào)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的KEGG代謝通路分析，從而甄選與鑒定出油脂合成關(guān)鍵調(diào)控酶。