[發(fā)明專利]細胞胞內(nèi)氨基酸代謝輪廓分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410581881.0
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN105527350A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設計）人: 許國旺;周麗娜;尹沛源;高鵬;路鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學領(lǐng)域，是一種針對少量細胞的胞內(nèi)氨基酸代謝輪 廓高通量分析方法。

背景技術(shù)

在系統(tǒng)生物學的理論框架下，借助代謝輪廓分析，將代謝表型及代謝 通路的擾動與其內(nèi)在的病理生理機制聯(lián)系起來的“多組學”研究已越來越多 地被用于癌癥研究,干細胞和藥效及藥物毒理研究中。細胞代謝輪廓分析是 實現(xiàn)上述研究目的的重要工具。在細胞代謝輪廓分析中，細胞培養(yǎng)耗時多、 預處理步驟繁雜等一直是限制分析通量提高的主要因素。利用96孔組織培 養(yǎng)板可以實現(xiàn)少量細胞(約10³-10⁴個)的快速培養(yǎng)及高通量操作。此外， 在干細胞的研究中，可用于代謝輪廓分析的干細胞數(shù)目相對較少，常規(guī)的 分析策略難以獲得豐富的代謝組數(shù)據(jù)。因此，實現(xiàn)少量細胞的代謝輪廓分 析方法具有重要意義。

雖然UPLC-MS分析靈敏度有了很大提高，但目前在檢測胞內(nèi)代謝組時 常需要大量細胞(>10⁶cells)。由于代謝物種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，在少量 細胞中代謝物整體含量較低，因此在代謝物分析的覆蓋率及靈敏度之間需 要一個合適的平衡點。因此，我們采用了“分而治之”的策略，即針對不同類 代謝物分別采用不同的預處理方法，提高其檢測靈敏度，實現(xiàn)對特定代謝 通路的覆蓋。氨基酸在細胞中具有非常重要的功能，既是蛋白質(zhì)的基本組 成單元，也是重要的代謝調(diào)節(jié)分子。如谷氨酰胺是某些癌細胞的必需氨基 酸，同時也用于維持三羧酸循環(huán)。同時，氨基酸可以通過代謝回補通路來 進出三羧酸循環(huán)，從而參與糖和脂類代謝，因而氨基酸代謝輪廓可以部分 反映中心碳代謝對內(nèi)外源干預的響應。

我們選擇針對96孔板培養(yǎng)的細胞為研究對象，并首先以檢測胞內(nèi)氨基 酸為目標來研發(fā)高通量、高靈敏的96孔板細胞胞內(nèi)代謝輪廓分析方法。提 出的具體實驗方案包括從細胞預處理到LC-MS分析的全部流程。通過開發(fā) 簡便的細胞淬滅提取程序，可以在簡化預處理步驟的同時，提高提取的重 復性。選用丹磺酰氯作為衍生化試劑，對氨基酸進行化學修飾，可以增加 極性較高的氨基酸類、其他含氨基或酚羥基化合物在液相上的保留，減少 離子抑制，改善分析精度，提高其檢測靈敏度。

針對96孔板接種培養(yǎng)的細胞的胞內(nèi)氨基酸類代謝輪廓分析，我們開發(fā) 了簡便的細胞淬滅提取程序，同時結(jié)合丹酰化修飾來提高氨基酸的分析靈 敏度，該方法可以實現(xiàn)對96孔板接種培養(yǎng)的10³-10⁴個細胞的胞內(nèi)代謝物的 高靈敏度、高通量檢測。這一結(jié)果突破了目前胞內(nèi)代謝物檢測中需要10⁶-10⁷ 量級細胞的限制，可用于高通量的代謝物功能闡釋，還可用于新藥快速篩 選，及無法獲得大量細胞的干細胞等相關(guān)研究中。我們將這一方法初步應 用于脂肪酸對HepG2細胞的干預實驗中，驗證了其實用性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于建立一種針對96孔組織培養(yǎng)板上生長的細胞胞內(nèi)代 謝輪廓分析方法，實現(xiàn)在少量細胞基礎上的高靈敏、高通量的代謝輪廓分 析，同時該方法也具有代謝淬滅和代謝物提取簡便的優(yōu)點。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

(1)96孔組織培養(yǎng)板中生長的細胞用冷PBS清洗后，利用冷甲醇/水對 細胞進行代謝淬滅和代謝物靜置提取。樣品淬滅、提取一步完成，預處理 過程簡單，無須凍融、超聲等細胞破碎過程；

(2)上清液或濾液用丹磺酰氯進行衍生，離心或過濾后上清用于上樣 分析。采用短柱分析，并優(yōu)化分離檢測條件，可實現(xiàn)10³-10⁴個細胞的胞內(nèi) 氨基酸及更多含氨基及酚羥基化合物的輪廓分析。

具體步驟如下(圖1)：

(1)在96孔組織培養(yǎng)板中生長的細胞，先用150-250μL0-4℃PBS快速 洗滌培養(yǎng)于96孔板每一孔中的細胞三次。(2)然后于96孔板每一孔中迅 速加入30-50μL淬滅溶液(0-4℃，含30-60％甲醇的水溶液，其中含濃 度為0.1-2.5μg/mL同位素內(nèi)標Ala-d⁴,Val-d⁸和Trp-d⁵)進行細胞代謝淬 滅；繼而在4℃下靜置提取30-60min.(3)將96孔板每一孔中提取液離心 或用96孔過濾板過濾后，取40-70μL上清或濾液用于衍生。