[發明專利]細胞胞內氨基酸代謝輪廓分析方法

在審

• 申請號: 201410581881.0
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN105527350A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 許國旺;周麗娜;尹沛源;高鵬;路鑫
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.細胞胞內氨基酸代謝輪廓分析方法，所述方法包括：

(a)取洗去培養基的細胞，利用冷甲醇水溶液對細胞進行代謝淬滅和低 溫靜置提取，離心或過濾，得細胞胞內代謝物提取液；

(b)采用丹磺酰氯作為衍生化試劑，對提取液中含氨基及酚羥基代謝 物進行衍生，終止衍生后，離心或過濾，收集衍生后的溶液；

(c)采用液相色譜-質譜聯用的方法，在正離子模式下對衍生后溶液中的 細胞胞內代謝物進行檢測。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于：步驟(c)采用高效液相色譜- 質譜法進行代謝輪廓分析；

以PBS清洗去除培養基后的細胞，得洗去培養基的細胞；PBS為預冷至 0-4℃的PBS緩沖鹽溶液。

3.根據權利要求1所述方法，其特征在于：冷甲醇水溶液為預冷至 0-4℃，體積含量30-60％甲醇的水溶液，甲醇的水溶液中還含有同位素內標， 同位素內標分別為濃度0.1-2.5μg/mL的Ala-d⁴、Val-d⁸和Trp-d⁵；

采用冷甲醇水溶液對細胞淬滅后，進行低溫靜置代謝物提取，提取條 件為：細胞淬滅后的混合液靜置于0-4℃環境下30-60分鐘。

4.根據權利要求1所述方法，其特征在于：用于細胞代謝物衍生的試 劑包括：緩沖鹽溶液，衍生化試劑以及終止衍生化反應試劑；終止衍生后， 離心或過濾，收集衍生后的溶液；

所述緩沖鹽溶液指的是0.1-0.5M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖鹽溶液；

采用0.5-5mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液作為衍生化試劑；

緩沖鹽溶液、衍生化試劑和提取液的體積比為1:1:1，衍生化反應溫度 為50-70℃,反應時間為40-60min。

5.根據權利要求3所述方法，其特征在于：

以d⁶-丹磺酰氯作為參照衍生化試劑，進行輔助鑒定；用于細胞代謝物 輔助衍生的試劑包括：緩沖鹽溶液，參照衍生化試劑以及終止衍生化反應 試劑；終止衍生后，離心或過濾，收集輔助衍生后的溶液；

所述緩沖鹽溶液指的是0.1-0.5M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖鹽溶液；

即采用0.5-5mg/mLd⁶-丹磺酰氯的乙腈溶液作為輔助衍生化試劑，對 提取液中含氨基及酚羥基代謝物進行輔助衍生化；

緩沖鹽溶液、附助衍生化試劑與提取液的體積比為1:1:1，衍生化反應 溫度為50-70℃,反應時間為40-60min。

6.根據權利要求1、3或4所述方法，其特征在于：所述終止衍生化反 應試劑指的是50-500μM丁胺水溶液，于每150μL衍生體系或輔助衍生體 系中終止衍生化反應試劑加入量為20-40μL。

7.根據權利要求4所述方法，其特征在于：輔助鑒定時，將輔助衍生 后的溶液與衍生后的溶液按等體積混合后再進行步驟(c)的檢測分析過程。

8.根據權利要求1所述方法，其特征在于：

所測標本為細胞，步驟(a)所取細胞數量在10³-10⁴之間。

9.根據權利要求1所述方法，其特征在于：經衍生的含氨基及酚羥基 代謝物，在正離子模式下，形成質荷比為M(分子量)+234.059，M+307.148。

10.根據權利要求1或8所述方法，其特征在于：所測標本為96孔板培 養的細胞，96孔板每一孔中培養的細胞為一個獨立的分析樣本。