[發明專利]一種百合脫毒籽球的快速培養方法

在審

• 申請號: 201410581640.6
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN105613283A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 楊長能
• 申請（專利權）人: 松桃宏發肉食品有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G1/00
• 代理公司: 貴陽天圣知識產權代理有限公司 52107
• 代理人: 杜勝雄

技術領域

本發明公開了切花百合脫毒培養的組培方法和利用鼓泡式生物反應器快速膨大脫毒小鱗莖(種球)的培養方法，屬于植物組培快繁技術領域和植物細胞工程的技術領域。

背景技術

百合是重要的觀賞花卉，主要用于切花品種生產。百合在開放條件下生長，不可避免地被病毒侵染，百合無癥病毒Lilysymptomlessvirus(LSV)、黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)、百合斑駁病毒Lilymottlevirus(LMoV)、郁金香碎花病毒Tulipbreakingvirus(TBV)和百合叢簇病毒Lilyrosettlevirus(LRV)是影響百合花卉生產的常見病毒。病毒侵染植株會造成百合農藝性狀嚴重退化，極大地影響了百合的生產。寄生在百合鱗莖中的病毒，隨著鱗莖芽眼萌發長成植株的生長過程，病毒會在百合植株體內進行復制繁殖，但在代謝活躍的莖尖分生組織中沒有病毒。百合脫毒技術就是利用莖尖部分沒有病毒的特性，在無菌環境條件下，利用人工配置的培養基，培育出無病毒試管苗或籽球，然后將組培苗和籽球在人工隔離或天然隔離條件下，生長成為供切花使用的商品種球。近年來國內百合的消費量逐年增大，但目前我國百合生產中，將近90%以上的種球依賴進口。少量的國產脫毒種球的生產，絕大多數采用傳統組培方式，不但生產周期長，而且還需要投入大量的人力，頻繁的更換培養基，生產過程需要很大的培養空間，為了保證培養空間溫濕度，滿足培養條件需要消耗很多能源。為了解決國產脫毒種球生產中存在的問題，特開展利用生物反應器快速培養百合脫毒籽球方法的研究。

發明內容

本發明包括:外植體滅菌和生長點的剝取；脫毒培養；組培各階段培養基的配比；脫毒籽球在反應器中的膨大培養；冷藏春化；馴化移栽幾個過程。本發明選用花卉市場大眾喜愛的“西伯利亞”(Siberia),“索幫”(Sorbonne),“馬可波羅”(Marcopolo),"曼妮莎”(Manissa),“康伽德奧”(Concad'0)5個品種為材料，采用綜合脫毒技術，即將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養相結合的方法。優化了脫毒百合種球組培培養基成分和培養程序，快速培養得到脫毒組培籽球，縮短了百合脫毒優質種球的快繁時間，同時籽球的定植成活率較高。本發明易于在切花百合原種的規模化快繁生產中推廣應用。

本發明通過以下技術方案實現:

一種百合脫毒籽球的快速培養方法方法，按如下步驟進行:

(1)百合種球的栽種:在35-38℃條件下種植百合種球，栽種后經7-15天的培養，待芽長高葉集生莖的中部形似蓮座狀。

(2)外植體滅菌和生長點的剝取:采集步驟(1)的百合莖尖，用中性肥皂水清洗3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0.1%升汞滅菌5-10分鐘，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍。外植體清洗干凈后，開始剝取生長點，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點，生長點長度為0.4-0.8(mm)，將剝取的生長點作為組培培養外植體。

(3)脫毒培養:將步驟(3)剝取的外植體百合莖尖生長點接種到誘導培養基(1/2MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4%蔗糖+瓊脂粉6g/L(pH5.8))，經過40-60天培養，生長點膨大成直徑2-3cm的葉叢。②將葉叢切成0.5cm小塊，接種于含病毒唑的培養基(MS+NAAO.2-0.5mg/L+4%蔗糖+病毒唑(Ribavirin)5-l0mg/L+瓊脂粉5g/L+O.5%活性炭(pH5.8))，經過40-60天培養，形成帶球的瓶苗。

(4)病毒檢測:將步驟②瓶苗進行酶聯免疫吸附測定實驗(ELISA)和RT-PCR檢測，確認無百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)病毒。

(5)脫毒籽球誘導培養:將步驟②經過病毒檢測無病毒脫毒瓶苗轉移到籽球誘導培養基(MS+KT2-5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4%蔗糖+瓊脂粉5g/L+O.5%活性炭(pH5.8))，在溫度22士1℃，光照強度1500Lx，光照12h/d的環境條件下培養40-60d，直接誘導出脫毒籽球。

(6)增殖培養:將步驟(4)組培籽球，切去葉片和部分基部組織后，縱切成3-4塊直徑0.3-0.5cm材料，接種于和籽球誘導培養相同的培養基上，在溫度22士1℃，光照12h/d，光照強度1000-1500Lx的環境條件下培養2個月，可以擴繁3-4倍。