[發明專利]一種百合脫毒籽球的快速培養方法

在審

• 申請號: 201410581640.6
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN105613283A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 楊長能
• 申請（專利權）人: 松桃宏發肉食品有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G1/00
• 代理公司: 貴陽天圣知識產權代理有限公司 52107
• 代理人: 杜勝雄

1.一種百合脫毒籽球的快速培養方法，其特征在于，按如下步驟進行：

(1)外植體滅菌和生長點的剝取：在35-38℃條件下種植百合種球，經過7-15天的培養，待芽長高并綻開成蓮座狀，開始采集百合莖尖，用中性肥皂水清洗3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0.1％升汞滅菌5-10分鐘，然后在70％酒精浸泡10-15秒；取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍；外植體清洗干凈后，開始剝取生長點，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點，生長點長度為0.4-0.8(mm)，將剝取的生長點立即接種；

(2)脫毒培養：步驟①誘導培養，剝取的百合莖尖生長點接種到誘導培養基(1/2MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4％蔗糖+瓊脂粉6g/L(pH5.8))，經過40-60天培養，生長點膨大成直徑2-3(cm)的葉叢；

②將葉叢切成0.5(em)小塊，接種于含病毒唑的培養基(MS+NAA0.2-0.5mg/L+4％蔗糖+病毒唑(Ribavirin)5-10mg/L+瓊脂粉5g/L+0.5％活性炭(pH5.8))，經過40-60天培養，形成帶球的瓶苗；

(3)病毒檢測：將步驟②瓶苗送到，農業部花卉產品質量監督檢驗測試中心(昆明)，經檢測確認無任何病蟲害現象并不帶百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)等病毒，才確認是百合脫毒種苗；

(4)脫毒籽球誘導培養：經過病毒檢測，將步驟②脫毒瓶苗轉移到籽球誘導培養基(MS+KT2-5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4％蔗糖+瓊脂粉5g/L+0.5％活性炭(pH5.8))，在溫度22±1℃，光照強度1500Lx，光照12h/d的環境條件下培養40-60d，直接誘導出脫毒籽球；

(5)增殖培養：將步驟(4)組培籽球，切去葉片和部分基部組織后，縱切成3-4塊直徑0.3-0.5cm材料，接種于和籽球誘導培養相同的培養基上，在溫度22±1℃，光照12h/d，光照強度1000-1500Lx的環境條件下培養2個月，可以擴繁3-4倍；

(6)脫毒籽球在生物反應器內液體培養：將步驟(5)培養的組培籽球分開，形成單個的小籽球，大約直徑0.3-0.5cm，然后接種于反應器內；液體培養基(MS+NAA0.2-0.5mg/L+吡效隆CPPU1-4mg/L+6％蔗糖(pH5.8))，在22±1℃、1500Lx和2L/min通氣量條件下培養45天，培養籽球直徑可達1.0-1.4cm，根系在3-5條/粒，籽球重0.7-1.2g/粒；

(7)冷藏：取出步驟(6)培養的脫毒籽球，用清水沖洗掉培養液，包裹于消毒草炭中，經3-4℃冷藏處理30-40天打破休眠；

(8)移栽馴化：將步驟(7)籽球取出，用2000倍阿米西達藥液浸泡籽球20分鐘，然后定植到80-90穴的穴簽中，穴盤基質：草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻裝盤；定植后澆透水，并用地膜覆蓋穴盤；放到網室內養護，晝溫20-25℃，夜溫10-15℃，盤土保持濕潤，定植成活后，每周噴一次1/2MS營養液；

(9)待籽球直徑長到2cm以上，可選擇具夏季冷涼氣候的800～1000米海拔地區，在避雨和防蟲隔離條件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。