[發(fā)明專利]一種菌絲生長活性測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410581044.8
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN105624259A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 申茂軍
• 申請（專利權(quán)）人: 申茂軍
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于活性測定方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種菌絲生長活性測定方法。

背景技術(shù)

對候選化合物進行有效、快速、靈敏的抗菌活性評價是殺菌劑篩選和研發(fā)中的重要環(huán)節(jié)，針對抗細菌和抗真菌活性成分的篩選，目前常用的抗菌活性測定方法主要有：藥劑擴散法（如打孔藥劑擴散法、濾紙片法、杯碟法）、生長速率法（如帶毒平板法、液體懸浮培養(yǎng)法、多孔板比濁度法）、孢子萌發(fā)法、通過檢測細胞酶活性的分光光度法等，這些方法各具優(yōu)點，同時也存在一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明就是針對上述問題，提供一種操作簡單、測定可靠的菌絲生長活性測定方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括以下步驟。

取一定量母液于PDA培養(yǎng)基中，充分混合，將混合好的培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)冷凝即成帶毒培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針或消毒的鑷子將制備好的菌餅反面移植到帶毒培養(yǎng)基上。設(shè)陰性對照、空白對照和陽性對照。

液體懸浮培養(yǎng)在活性測定之前確定供試病原真菌在液體懸浮培養(yǎng)中的最佳收獲期，挑取新鮮菌絲于無菌馬鈴薯-葡萄糖-液體培養(yǎng)基中，同時含有相應(yīng)的有機溶劑，搖床培養(yǎng)，，采用過濾法收集菌絲，烘干至恒重，求其平均值，在此基礎(chǔ)上繪制菌絲生長曲線，將供試樣品用合適的溶劑配成系列濃度的母液，然后取一定量于真菌培養(yǎng)液中。

用接種針將制備好的菌餅挑到混合好的帶毒PDB培養(yǎng)液中。然后搖床培養(yǎng)，待菌絲生長到最佳收獲期時，采用過濾法收集菌絲，烘干菌絲至恒重。實驗設(shè)陰性對照、空白對照和陽性對照。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述取一定量母液于PDA培養(yǎng)基中，充分混合，化合物在培養(yǎng)液中的濃度分別為：256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL和8μg/mL；將混合好的培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)冷凝即成帶毒培養(yǎng)基；待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針或消毒的鑷子將制備好的菌餅反面移植到帶毒培養(yǎng)基上，1個培養(yǎng)皿中央接1個菌餅；設(shè)陰性對照、空白對照和陽性對照，每個處理重復(fù)3次。

作為另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述液體懸浮培養(yǎng)在活性測定之前確定3種供試病原真菌在液體懸浮培養(yǎng)中的最佳收獲期，挑取新鮮菌絲于無菌馬鈴薯-葡萄糖-液體培養(yǎng)基中，同時含有相應(yīng)的1%的有機溶劑，搖床培養(yǎng)5-8天，每天取出3瓶，采用過濾法收集菌絲，于60°C下烘干至恒重，求其平均值，在此基礎(chǔ)上繪制菌絲生長曲線，將供試樣品用合適的溶劑配成系列濃度的母液：2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL和0.0625mg/mL，然后取一定量于真菌培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中的濃度分別為：20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL。

用接種針將制備好的菌餅挑到混合好的帶毒PDB培養(yǎng)液中，1個三角瓶中接種1個菌餅；然后搖床培養(yǎng)，待菌絲生長到最佳收獲期時，采用過濾法收集菌絲，于60°C下烘干菌絲至恒重；實驗設(shè)陰性對照、空白對照和陽性對照，每個處理重復(fù)3次。

本發(fā)明有益效果。

本發(fā)明測定菌絲在固體培養(yǎng)基上生長，菌絲的生長速度一般是以菌落擴展的直徑來間接衡量；操作比較簡單，對抗菌化合物的主要劑型都很適合，重現(xiàn)性好，便可得到可靠的結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明包括以下步驟。

取一定量母液于PDA培養(yǎng)基中，充分混合，將混合好的培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)冷凝即成帶毒培養(yǎng)基；待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針或消毒的鑷子將制備好的菌餅反面移植到帶毒培養(yǎng)基上；設(shè)陰性對照、空白對照和陽性對照。

液體懸浮培養(yǎng)在活性測定之前確定供試病原真菌在液體懸浮培養(yǎng)中的最佳收獲期，挑取新鮮菌絲于無菌馬鈴薯-葡萄糖-液體培養(yǎng)基中，同時含有相應(yīng)的有機溶劑，搖床培養(yǎng)，，采用過濾法收集菌絲，烘干至恒重，求其平均值，在此基礎(chǔ)上繪制菌絲生長曲線，將供試樣品用合適的溶劑配成系列濃度的母液，然后取一定量于真菌培養(yǎng)液中。

用接種針將制備好的菌餅挑到混合好的帶毒PDB培養(yǎng)液中；然后搖床培養(yǎng)，待菌絲生長到最佳收獲期時，采用過濾法收集菌絲，烘干菌絲至恒重；實驗設(shè)陰性對照、空白對照和陽性對照。