[發(fā)明專利]APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410580775.0
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104313184A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李應(yīng)國;聶福平;楊俊;王昱;陳玉燕;王國民
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市恒信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法及檢驗(yàn)試劑領(lǐng)域，具體涉及豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌APP、豬肺炎支原體M.hyo、圓環(huán)病毒2型PCV-2及豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV多重PCR檢測用檢測用引物、試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)

豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）就是由病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲、環(huán)境因素、斷奶轉(zhuǎn)群應(yīng)激和豬體免疫力低下等多種因素引起的豬呼吸道疾病的總稱。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、氣喘、呼吸困難、腹式呼吸、眼鼻分泌物增多、厭食、迅速消瘦、被毛粗亂，可發(fā)生突然死亡。該病發(fā)病率可達(dá)60%，病死率為20%-90%。在仔豬斷奶后，特別是18-20周齡的育成豬，臨床癥狀尤為明顯，對豬群危害十分嚴(yán)重。該病已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病之一,近幾年在我國部分地區(qū)的豬場也迅速蔓延開來，嚴(yán)重制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。其中，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒等均為常見的PRDC原發(fā)性病原體，臨床癥狀極為相似難以區(qū)分，而且往往表現(xiàn)為混合感染。目前，現(xiàn)有的檢測APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV的方法主要依靠病理解剖、病原菌分離、血清學(xué)方法等傳統(tǒng)的方法，其操作繁雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性低，難以直接分辨出APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV四種病菌。因此，急需建立一種快速、敏感、方便的特異性檢測方法應(yīng)對日趨復(fù)雜的豬混合病原體感染的檢測。多重PCR?是一種利用多條特異性引物在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的方法，具有操作簡單、快速、特異性和敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，并在動(dòng)物病原檢測中被廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一套豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒四重PCR檢測的引物以及試劑盒。第二個(gè)目的是提供使用該引物用于豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒的四重PCR檢測的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述第一目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：根據(jù)GenBank?發(fā)表的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒的保守基因核苷酸序列，用軟件Primer?Primer?5.0軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行BLAST序列比對初步驗(yàn)證引物特異性，其引物如下：

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的PCR特異性上游引物，其DNA序列為APP?SEQ?NO.1；

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的PCR特異性下游引物，其DNA序列為APP?SEQ?NO.2；

豬肺炎支原體的PCR特異性上游引物，其DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.3；

豬肺炎支原體的PCR特異性下游引物，其DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.4；

豬圓環(huán)病毒2?型的PCR特異性上游引物，其DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.5；

豬圓環(huán)病毒2?型的PCR特異性下游引物，其DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.6；

豬繁殖與呼吸綜合征病毒的PCR特異性上游引物，其DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.7；

豬繁殖與呼吸綜合征病毒的PCR特異性下游引物，其DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.8。

本發(fā)明提供的PCR檢測用試劑盒包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，所述擴(kuò)增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成：

DNA序列為APP?SEQ?NO.1?的20μmol/L的APP上游引物0.25μL；

DNA序列為APP?SEQ?NO.2?的20μmol/L的APP下游引物0.25μL；

DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.3?的20μmol/L的M.hyo上游引物0.25μL；

DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.4?的20μmol/L的M.hyo下游引物0.25μL；

DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.5?的20μmol/L的PCV-2上游引物0.25μL；

DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.6?的20μmol/L的PCV-2下游引物0.25μL；

DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.7?的20μmol/L的PRRSV上游引物0.25μL；

DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.8?的20μmol/L的PRRSV下游引物0.25μL；

2×Premix?Ex?Taq緩沖液?12.5μL；

滅菌去離子水?9.5μL；