[發明專利]APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201410580775.0
• 申請日: 2014-10-27
• 公開（公告）號: CN104313184A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 李應國;聶福平;楊俊;王昱;陳玉燕;王國民
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

1.?APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR檢測用引物，其特征在于：包括

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的PCR特異性上游引物，其DNA序列為APP?SEQ?NO.1；

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的PCR特異性下游引物，其DNA序列為APP?SEQ?NO.2；

豬肺炎支原體的PCR特異性上游引物，其DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.3；

豬肺炎支原體的PCR特異性下游引物，其DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.4；

豬圓環病毒2?型的PCR特異性上游引物，其DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.5；

豬圓環病毒2?型的PCR特異性下游引物，其DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.6；

豬繁殖與呼吸綜合征病毒的PCR特異性上游引物，其DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.7；

豬繁殖與呼吸綜合征病毒的PCR特異性下游引物，其DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.8。

2.APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR檢測用試劑盒，其特征在于：包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成：

DNA序列為APP?SEQ?NO.1?的20μmol/L的APP上游引物0.25μL；

DNA序列為APP?SEQ?NO.2?的20μmol/L的APP下游引物0.25μL；

DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.3?的20μmol/L的M.hyo上游引物0.25μL；

DNA序列為M.hyo?SEQ?NO.4?的20μmol/L的M.hyo下游引物0.25μL；

DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.5?的20μmol/L的PCV-2上游引物0.25μL；

DNA序列為PCV-2?SEQ?NO.6?的20μmol/L的PCV-2下游引物0.25μL；

DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.7?的20μmol/L的PRRSV上游引物0.25μL；

DNA序列為PRRSV?SEQ?NO.8?的20μmol/L的PRRSV下游引物0.25μL；

2×Premix?Ex?Taq緩沖液?12.5μL；

滅菌去離子水?9.5μL；

合計24μL，為單次反應的用量；

所述陽性對照管，管內為陽性豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、陽性豬肺炎支原體、陽性豬圓環病毒2?型及陽性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的重組質粒DNA，體積為20μL；

所述陰性對照管，管內為無豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬組織基因組DNA，體積為20μL；

所述滅菌去離子水管?1mL～2mL。

3.根據權利要求書2所述APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR檢測用試劑盒，其特征在于：所述陽性對照管內的重組質粒DNA由如下反應獲得：分別以如下引物組APP?SEQ?NO.1和APP?SEQ?NO.2，M.hyo?SEQ?NO.3和M.hyo?SEQ?NO.4，PCV-2?SEQ?NO.5和PCV-2?SEQ?NO.6，PRRSV?SEQ?NO.7和PRRSV?SEQ?NO.8，按常規方法進行PCR擴增，分別將PCR擴增產物與pMD19-T載體進行連接反應獲得所述陽性重組質粒DNA。

4.利用權利要求2或3所述試劑盒進行豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR非疾病檢測目的的檢測方法：包括如下步驟：

1）制備待檢模板DNA：選用商品化的細胞培養液DNA提取試劑盒，提取待測樣品中DNA，獲得待檢模板DNA；

2）擴增反應體系為：24μL擴增反應液；1μL待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為25μL;

3）多重PCR擴增：將步驟2）配制好的擴增反應體系進行PCR擴增，反應條件：預變性94.0℃?5?min；94.0?℃?變性30?s，58.0℃～61.0℃?退火?30?s，72.0?℃?延伸?30?s，35個循環；72.0?℃?延伸7min；4.0?℃保存；

4）結果判定：2%瓊脂糖凝膠結果判定，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2?型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性分別在107bp、176bp、337bp及225bp處出現特異性擴增條帶。