[發明專利]一種基于目標觸發的可二次擴增的探針及其應用

在審

• 申請號: 201410579896.3
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN105087555A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 吳昊;鄒霈;劉婭靈;王洪勇;吳軍;諸飛帆
• 申請（專利權）人: 江蘇省原子醫學研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 趙敏

技術領域

本發明屬于分子生物信息學領域，具體涉及一種基于目標觸發的可二次擴增的探針及其應用。

背景技術

在突變分析、臨床診斷和基因治療中，微量DNA的檢測起著至關重要的作用。為了檢測微量的DNA，則需要構建檢測靈敏度高的DNA生物傳感器。目前，有采用信號擴增策略來實現高靈敏度檢測的傳感器，這些高靈敏度的傳感器主要集中于核酸研究的領域，采用的擴增方法包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和滾環擴增(RCA)等。雖然采用上述方法可以實現對目標檢測物的高靈敏分析，但是通常涉及多個分析步驟，并且需要加入許多外源試劑。因此，目前亟待提出一種操作簡單、成本低同時具有高靈敏度的檢測微量DNA的方法。

脫氧核酶(DNA酶)屬于人工核酸的一種，通過體外選擇被分離出來，具有對特定底物的高催化活性、較好的熱穩定性，可以多次變性復性而不丟失催化活性等優點，是生物應用中理想的信號擴增的生物催化劑。在DNA酶領域，G-四鏈體-氯血紅素DNA酶的發現引起了廣泛的關注。G-四鏈體序列可以結合輔助因子--氯化血紅素，形成仿過氧化物酶DNA酶，進而將H₂O₂介導的2,2'-聯氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成綠色的ABTS^·-，或提高魯米諾-過氧化氫體系的化學發光。基于該原理，G-四鏈體-氯血紅素DNA酶已被開發出了許多比色、化學發光或熒光的傳感平臺。但是利用上述原理進行DNA分析的比色探針較為少見，更無法達到檢測微量DNA的靈敏度。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是現有技術中檢測微量DNA分析步驟復雜、需要加入許多外源試劑，進而提供一種操作簡單、成本低同時具有高靈敏度的檢測微量DNA的方法。

本發明所要解決的第二個技術問題是現有技術中基于G-四鏈體-氯血紅素DNA酶的探針無法達到檢測微量DNA的靈敏度，進而提供一種基于目標觸發的可二次擴增的、可檢測微量DNA的、高靈敏度的探針。

本發明的基于目標觸發的可二次擴增的探針，所述探針包括第一發夾、第二發夾以及第三發夾；所述第一發夾、第二發夾以及第三發夾均為單鏈線形分子自身回折后，折疊區域內的互補堿基配對雜交而成，其局部區域形成雙鏈結構的部分為莖干區，未形成雙鏈結構并回折的部分為環狀區；

所述第一發夾包括：識別目標DNA的識別區以及與所述識別區部分雜交形成發夾結構的第一莖干區；

所述第二發夾包括：與所述第一發夾的識別區部分雜交的堿基互補區；

所述第三發夾包括：可與所述第一發夾的第一莖干區部分雜交的第二莖干區以及G-四鏈體區。

發夾結構是指，DNA單鏈線形分子自身回折后，折疊區域內的互補堿基配對雜交而形成的結構。本發明中，所述第一發夾、第二發夾、第三發夾的環狀區是指，在發夾結構中，未形成雙鏈結構的、回折的部分。所述莖干區是指，形成雙鏈結構的部分。所述第一莖干區、第二莖干區可以是完整的莖干區，也可以是所述莖干區的一部分。

所述G-四鏈體區具有如SEQIDNo.1所示的序列結構，序列SEQIDNo.1為：5’-TATGGGTTGGGCGGGATGGG-3’。

所述第一發夾、第二發夾、第三發夾中，所述環狀區的堿基個數與所述莖干區的堿基個數的比值大于2。

所述第一發夾、第二發夾、第三發夾中，所述莖干區的序列長度為5-16個堿基，且在所述堿基中，胞嘧啶和鳥嘌呤的個數分別占總堿基數的60％以下。

所述第一發夾、第二發夾、第三發夾的5’端的第一個堿基為胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶中的一種。

作為本發明的具體設計方式，所述第一發夾具有如SEQIDNo.2所示的結構，所述第二發夾具有如SEQIDNo.3所示的結構，所述第三發夾具有如SEQIDNo.4所示的結構。具體來說，

序列SEQIDNo.2為：5’-GTGACTAGATCTACATATTGCCATCTGTAACAATATGTAGATCTATGGGTTTTTT-3’；

序列SEQIDNo.3為：5’-TATTGTTACAGATGGCAATATGTAGATCTACCATCTGTAATTTT-3’；

序列SEQIDNo.4為：5’-TATGGGTTGGGCGGGATGGGAACCCATAGATCTACA-3’。