[發明專利]一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法在審
| 申請號: | 201410579602.7 | 申請日: | 2014-10-24 |
| 公開(公告)號: | CN104330370A | 公開(公告)日: | 2015-02-04 |
| 發明(設計)人: | 黎洪;王海兵;胡海艷;黃魁英;謝鵬;夏楓耿;高建勝;司徒少金;陳禧翎 | 申請(專利權)人: | 廣州白云山明興制藥有限公司;廣州市微生物研究所 |
| 主分類號: | G01N21/31 | 分類號: | G01N21/31 |
| 代理公司: | 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102 | 代理人: | 陳衛 |
| 地址: | 510000 廣東*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 甲硫氨酸 裂解 活性 檢測 方法 | ||
技術領域
本發明屬于生物醫藥技術領域,具體涉及一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法。?
背景技術
甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionineγ-lyase;E4.4.1.11)簡稱MGL,是一種磷酸吡哆醛(PLP)依賴酶,屬于γ-蛋白家族。它能催化L-甲硫氨酸的γ-消除反應生成甲硫醇、氨和α-丁酮酸。此外,MGL還能催化L-半胱氨酸及其衍生物的α,β-消除反應及β取代反應。MGL是生物體內甲硫氨酸代謝調控的關鍵酶,在含硫氨基酸的代謝中發揮著重要的作用。腫瘤細胞對甲硫氨酸的需求非常旺盛,缺乏該氨基酸的情況下多種腫瘤細胞生長停止,而正常的細胞在甲硫氨酸缺乏下仍然正常。有學者在體外細胞培養試驗及動物體內試驗證明MGL對肺癌、結腸癌、腎癌、等甲硫氨酸依賴性腫瘤具有抗腫瘤作用,并通過Ⅰ期臨床試驗,證明其具有用于臨床的安全性和可靠性。與傳統化療方法相比,MGL作為新型抗腫瘤藥物具有腫瘤特異性高,毒副作用小等特點,顯示出巨大的臨床應用潛力。作為一種極具潛力開發成抗腫瘤藥物的酶類,其最重要的酶活力指標的準確測定變得十分重要。?
目前,國內外檢測MGL酶活力的方法主要有兩種:一是采用檢測生成物氨的方法測定酶活,即在MGL作用于底物后產生氨,依據α-酮戊二酸+NH4++NADH→谷氨酸+NAD+反應中NADH的消耗速率與NH3生成濃度呈正比的原理,利用自動生化監測分析儀直接測定反應液中氨的含量,計算出酶活;二是采用檢測生成物α-丁酮酸的方法測定酶活,即在MGL作用于底物產生α-丁酮酸,α-丁酮酸與3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)反應,測定生成物的吸光值,用分光光度法計算α-丁酮酸的量,從而計算酶活。?
直接檢測氨的方法測定MGL酶活力,方便省時,但由于本底氨濃度的原因,使測定精度受到影響。試驗發現在MGL酶液、底物溶液、水中均含氨,其中以酶液中氨含量相對較高,故測出的酶活力往往偏高。通過檢測α-丁酮酸的生成量?來計算酶活的方法,雖較好地解決了本底氨對酶活性測試的干擾,使得測量值比較準確,是目前文獻里最通用的MGL酶活測定方法。但是酶活方法本身的影響因素多且復雜,如果僅依據現有文獻報道的方法進行酶活測定來進行質量研究,由于沒有對照品的參照,顯然不能滿足藥品質量分析中對精密度要求高的方法學要求。?
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中缺乏對照品、檢測方法中精密度低的缺陷,提供了一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法;本發明增加α-丁酮酸作為對照物質,通過方法學的驗證,得到了一種精密度高的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法。?
一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法,包括如下步驟:?
S1:α-丁酮酸對照品溶液的制備?
稱取α-丁酮酸,用水配制成0.000025~0.00025mol/L的溶液,作為對照品溶液;?
S2:甲硫氨酸γ-裂解酶酶供試品溶液的制備?
稱取供試品,加酶稀釋液、二硫蘇糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液,配制成供試品溶液;?
S3:酶解反應?
取至少兩支離心管,其中一支離心管編號為N0;向其余各離心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液,并于37℃預熱;然后向離心管N0中加入體積為V1的三氯乙酸溶液,同時向其它離心管中各加入體積為V2的供試品溶液,然后將這些離心管置于37℃水浴中反應;反應結束后立即向離心管N0中加入體積為V2的供試品溶液,同時向其它離心管中各加入體積為V1的三氯乙酸溶液,搖勻;將離心管N0作為空白反應液,其余離心管作為酶解反應液;?
其中,所述底物溶液為由KH2PO4-K2HPO4緩沖液和L-甲硫氨酸組成的混合溶液;?
S4:α-丁酮酸含量的測定?
S41:量取步驟S3所得的空白反應液體積為V3置于離心管中,然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液,搖勻,備用;?
S42:量取步驟S3所得的酶解反應液體積為V3置于離心管中,然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液,搖勻,備用;?
S43:量取體積為V3的水置于離心管中,然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液,搖勻,作為空白對照液,備用;?
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