[發(fā)明專(zhuān)利]一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410579602.7
• 申請(qǐng)日: 2014-10-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104330370A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎洪;王海兵;胡海艷;黃魁英;謝鵬;夏楓耿;高建勝;司徒少金;陳禧翎
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州白云山明興制藥有限公司;廣州市微生物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 代理公司: 廣州粵高專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionineγ-lyase；E4.4.1.11)簡(jiǎn)稱(chēng)MGL，是一種磷酸吡哆醛(PLP)依賴(lài)酶，屬于γ-蛋白家族。它能催化L-甲硫氨酸的γ-消除反應(yīng)生成甲硫醇、氨和α-丁酮酸。此外，MGL還能催化L-半胱氨酸及其衍生物的α,β-消除反應(yīng)及β取代反應(yīng)。MGL是生物體內(nèi)甲硫氨酸代謝調(diào)控的關(guān)鍵酶，在含硫氨基酸的代謝中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤細(xì)胞對(duì)甲硫氨酸的需求非常旺盛，缺乏該氨基酸的情況下多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停止，而正常的細(xì)胞在甲硫氨酸缺乏下仍然正常。有學(xué)者在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)證明MGL對(duì)肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、等甲硫氨酸依賴(lài)性腫瘤具有抗腫瘤作用，并通過(guò)Ⅰ期臨床試驗(yàn)，證明其具有用于臨床的安全性和可靠性。與傳統(tǒng)化療方法相比，MGL作為新型抗腫瘤藥物具有腫瘤特異性高，毒副作用小等特點(diǎn)，顯示出巨大的臨床應(yīng)用潛力。作為一種極具潛力開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物的酶類(lèi)，其最重要的酶活力指標(biāo)的準(zhǔn)確測(cè)定變得十分重要。?

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)MGL酶活力的方法主要有兩種：一是采用檢測(cè)生成物氨的方法測(cè)定酶活，即在MGL作用于底物后產(chǎn)生氨，依據(jù)α-酮戊二酸+NH₄⁺+NADH→谷氨酸+NAD⁺反應(yīng)中NADH的消耗速率與NH₃生成濃度呈正比的原理，利用自動(dòng)生化監(jiān)測(cè)分析儀直接測(cè)定反應(yīng)液中氨的含量，計(jì)算出酶活；二是采用檢測(cè)生成物α-丁酮酸的方法測(cè)定酶活，即在MGL作用于底物產(chǎn)生α-丁酮酸，α-丁酮酸與3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)反應(yīng)，測(cè)定生成物的吸光值，用分光光度法計(jì)算α-丁酮酸的量，從而計(jì)算酶活。?

直接檢測(cè)氨的方法測(cè)定MGL酶活力，方便省時(shí)，但由于本底氨濃度的原因，使測(cè)定精度受到影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在MGL酶液、底物溶液、水中均含氨，其中以酶液中氨含量相對(duì)較高，故測(cè)出的酶活力往往偏高。通過(guò)檢測(cè)α-丁酮酸的生成量?來(lái)計(jì)算酶活的方法，雖較好地解決了本底氨對(duì)酶活性測(cè)試的干擾，使得測(cè)量值比較準(zhǔn)確，是目前文獻(xiàn)里最通用的MGL酶活測(cè)定方法。但是酶活方法本身的影響因素多且復(fù)雜，如果僅依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行酶活測(cè)定來(lái)進(jìn)行質(zhì)量研究，由于沒(méi)有對(duì)照品的參照，顯然不能滿(mǎn)足藥品質(zhì)量分析中對(duì)精密度要求高的方法學(xué)要求。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏對(duì)照品、檢測(cè)方法中精密度低的缺陷，提供了一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測(cè)方法；本發(fā)明增加α-丁酮酸作為對(duì)照物質(zhì)，通過(guò)方法學(xué)的驗(yàn)證，得到了一種精密度高的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測(cè)方法。?

一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測(cè)方法,包括如下步驟：?

S1：α-丁酮酸對(duì)照品溶液的制備?

稱(chēng)取α-丁酮酸，用水配制成0.000025～0.00025mol/L的溶液，作為對(duì)照品溶液；?

S2：甲硫氨酸γ-裂解酶酶供試品溶液的制備?

稱(chēng)取供試品，加酶稀釋液、二硫蘇糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制成供試品溶液；?

S3：酶解反應(yīng)?

取至少兩支離心管，其中一支離心管編號(hào)為N0；向其余各離心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37℃預(yù)熱；然后向離心管N0中加入體積為V1的三氯乙酸溶液，同時(shí)向其它離心管中各加入體積為V2的供試品溶液，然后將這些離心管置于37℃水浴中反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后立即向離心管N0中加入體積為V2的供試品溶液，同時(shí)向其它離心管中各加入體積為V1的三氯乙酸溶液，搖勻；將離心管N0作為空白反應(yīng)液，其余離心管作為酶解反應(yīng)液；?

其中，所述底物溶液為由KH₂PO₄-K₂HPO₄緩沖液和L-甲硫氨酸組成的混合溶液；?

S4：α-丁酮酸含量的測(cè)定?

S41：量取步驟S3所得的空白反應(yīng)液體積為V3置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；?

S42：量取步驟S3所得的酶解反應(yīng)液體積為V3置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；?

S43：量取體積為V3的水置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，作為空白對(duì)照液，備用；?