[發明專利]一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法

在審

• 申請號: 201410579602.7
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104330370A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 黎洪;王海兵;胡海艷;黃魁英;謝鵬;夏楓耿;高建勝;司徒少金;陳禧翎
• 申請（專利權）人: 廣州白云山明興制藥有限公司;廣州市微生物研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法。?

背景技術

甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionineγ-lyase；E4.4.1.11)簡稱MGL，是一種磷酸吡哆醛(PLP)依賴酶，屬于γ-蛋白家族。它能催化L-甲硫氨酸的γ-消除反應生成甲硫醇、氨和α-丁酮酸。此外，MGL還能催化L-半胱氨酸及其衍生物的α,β-消除反應及β取代反應。MGL是生物體內甲硫氨酸代謝調控的關鍵酶，在含硫氨基酸的代謝中發揮著重要的作用。腫瘤細胞對甲硫氨酸的需求非常旺盛，缺乏該氨基酸的情況下多種腫瘤細胞生長停止，而正常的細胞在甲硫氨酸缺乏下仍然正常。有學者在體外細胞培養試驗及動物體內試驗證明MGL對肺癌、結腸癌、腎癌、等甲硫氨酸依賴性腫瘤具有抗腫瘤作用，并通過Ⅰ期臨床試驗，證明其具有用于臨床的安全性和可靠性。與傳統化療方法相比，MGL作為新型抗腫瘤藥物具有腫瘤特異性高，毒副作用小等特點，顯示出巨大的臨床應用潛力。作為一種極具潛力開發成抗腫瘤藥物的酶類，其最重要的酶活力指標的準確測定變得十分重要。?

目前，國內外檢測MGL酶活力的方法主要有兩種：一是采用檢測生成物氨的方法測定酶活，即在MGL作用于底物后產生氨，依據α-酮戊二酸+NH₄⁺+NADH→谷氨酸+NAD⁺反應中NADH的消耗速率與NH₃生成濃度呈正比的原理，利用自動生化監測分析儀直接測定反應液中氨的含量，計算出酶活；二是采用檢測生成物α-丁酮酸的方法測定酶活，即在MGL作用于底物產生α-丁酮酸，α-丁酮酸與3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)反應，測定生成物的吸光值，用分光光度法計算α-丁酮酸的量，從而計算酶活。?

直接檢測氨的方法測定MGL酶活力，方便省時，但由于本底氨濃度的原因，使測定精度受到影響。試驗發現在MGL酶液、底物溶液、水中均含氨，其中以酶液中氨含量相對較高，故測出的酶活力往往偏高。通過檢測α-丁酮酸的生成量?來計算酶活的方法，雖較好地解決了本底氨對酶活性測試的干擾，使得測量值比較準確，是目前文獻里最通用的MGL酶活測定方法。但是酶活方法本身的影響因素多且復雜，如果僅依據現有文獻報道的方法進行酶活測定來進行質量研究，由于沒有對照品的參照，顯然不能滿足藥品質量分析中對精密度要求高的方法學要求。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中缺乏對照品、檢測方法中精密度低的缺陷，提供了一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法；本發明增加α-丁酮酸作為對照物質，通過方法學的驗證，得到了一種精密度高的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法。?

一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法,包括如下步驟：?

S1：α-丁酮酸對照品溶液的制備?

稱取α-丁酮酸，用水配制成0.000025～0.00025mol/L的溶液，作為對照品溶液；?

S2：甲硫氨酸γ-裂解酶酶供試品溶液的制備?

稱取供試品，加酶稀釋液、二硫蘇糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制成供試品溶液；?

S3：酶解反應?

取至少兩支離心管，其中一支離心管編號為N0；向其余各離心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37℃預熱；然后向離心管N0中加入體積為V1的三氯乙酸溶液，同時向其它離心管中各加入體積為V2的供試品溶液，然后將這些離心管置于37℃水浴中反應；反應結束后立即向離心管N0中加入體積為V2的供試品溶液，同時向其它離心管中各加入體積為V1的三氯乙酸溶液，搖勻；將離心管N0作為空白反應液，其余離心管作為酶解反應液；?

其中，所述底物溶液為由KH₂PO₄-K₂HPO₄緩沖液和L-甲硫氨酸組成的混合溶液；?

S4：α-丁酮酸含量的測定?

S41：量取步驟S3所得的空白反應液體積為V3置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；?

S42：量取步驟S3所得的酶解反應液體積為V3置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；?

S43：量取體積為V3的水置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，作為空白對照液，備用；?