[發(fā)明專利]一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410579602.7
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104330370A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黎洪;王海兵;胡海艷;黃魁英;謝鵬;夏楓耿;高建勝;司徒少金;陳禧翎
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州白云山明興制藥有限公司;廣州市微生物研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

1.一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法,其特征在于，包括如下步驟：

S1：α-丁酮酸對照品溶液的制備

稱取α-丁酮酸，用水配制成0.000025～0.00025mol/L的溶液，作為對照品溶液；

S2：供試品溶液的制備

稱取供試品，加酶稀釋液、二硫蘇糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制成供試品溶液；

S3：酶解反應

取至少兩支離心管，其中一支離心管編號為N0；向其余各離心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37℃預熱；然后向離心管N0中加入體積為V1的三氯乙酸溶液，同時向其它離心管中各加入體積為V2的供試品溶液，然后將這些離心管置于37℃水浴中反應；反應結(jié)束后立即向離心管N0中加入體積為V2的供試品溶液，同時向其它離心管中各加入體積為V1的三氯乙酸溶液，搖勻；將離心管N0作為空白反應液，其余離心管作為酶解反應液；

其中，所述底物溶液為由KH₂PO₄-K₂HPO₄緩沖液和L-甲硫氨酸組成的混合溶液；

S4：α-丁酮酸含量的測定

S41：量取步驟S3所得的空白反應液體積為V3置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；

S42：量取步驟S3所得的酶解反應液體積為V3置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；

S43：量取體積為V3的水置于離心管中，然后加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，作為空白對照液，備用；

將上述各離心管放置于50℃水浴中進行反應，然后冷卻降溫，采用紫外-可見分光光度法，在315～325nm波長處，分別測定空白反應液、酶解反應液、α-丁酮酸對照品溶液的吸光度A0、At、As，并根據(jù)如下公式計算反應液中酶的效價：

其中，M為反應常數(shù)，M＝2.3C，C為α-丁酮酸對照品溶液的濃度；

F為實際稱樣量制備的酶液濃度與計算稱樣量制備的酶液濃度的比值；

取樣量為MGL酶的實際稱樣量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S2中的所述供試品為甲硫氨酸γ-裂解酶或甲硫氨酸γ-裂解酶凍干粉制劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S2中的所述供試品溶液中酶的配置濃度為0.0575～0.575U/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S2中的所述供試品溶液中酶的配置濃度為0.3U/ml，所述M的值為0.345。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S2中的酶稀釋液為pH＝8.0、濃度為100mmol/L的KH₂PO₄-K₂HPO₄緩沖液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S2中的二硫蘇糖醇溶液的質(zhì)量體積分數(shù)為0.01％；乙二胺四乙酸溶液的濃度為1mmol/L；所述磷酸吡哆醛溶液的濃度為0.01mmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S3中的KH₂PO₄-K₂HPO₄緩沖液為pH＝8.0、濃度為100mmol/L的溶液，所述L-甲硫氨酸的濃度為25mmol/L；所述磷酸吡哆醛的濃度為0.01mmol/L；所述三氯乙酸溶液的質(zhì)量體積分數(shù)為50％。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟S4中的乙酸鈉溶液為pH＝5.0、濃度為1mol/L的溶液；所述3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液的質(zhì)量體積分數(shù)為0.1％。