[發明專利]一種靶向肽修飾的金納米顆粒及其制備方法和其作為四價鉑前體藥物載體的應用

在審

• 申請號: 201410578811.X
• 申請日: 2014-10-25
• 公開（公告）號: CN104667290A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 劉蕾;劉揚中
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: A61K47/42
• 分類號: A61K47/42;A61K9/14;A61K31/282;A61K33/24;A61P35/00
• 代理公司: 北京科迪生專利代理有限責任公司 11251
• 代理人: 楊學明;顧煒

1.一種肝癌細胞靶向肽修飾的金納米顆粒，其特征在于，所述靶向肽修飾的金納米顆粒對肝癌細胞具有選擇性。

2.根據權利要求1所述的一種肝癌細胞靶向肽修飾的金納米顆粒，其特征在于，所述的靶向肽含有14-20個氨基酸，其中包含具有肝癌細胞靶向作用的SFSIIHTPILPL即SP94序列，所述的肽序列中含有1-3個半胱氨酸殘基。

3.根據權利要求1所述的一種肝癌細胞靶向肽修飾的金納米顆粒，其特征在于，所述的肝癌細胞靶向肽修飾的金納米顆粒是通過肽分子中的巰基與金形成金硫共價鍵將肽連接到金納米顆粒的表面。

4.根據權利要求1所述的一種肝癌細胞靶向肽修飾的金納米顆粒，其特征在于，該靶向肽修飾的金納米顆粒是通過如下步驟所制得的：

(1)制備十六烷基三甲基溴化氨CTAB穩定的金納米顆粒：用十六烷基三甲基溴化氨作為軟性模板劑，采用種子生長法制備金納米顆粒或者用檸檬酸鈉作為還原劑制備金納米顆粒；

(2)制備靶向肽結合的金納米顆粒：向步驟(1)金納米顆粒溶膠，其在800nm左右處吸收值為1中加入肝癌細胞靶向肽1～5mg/ml反應；反應4～8小時后，通過離心的方法將沒有反應的肽去除，將反應液在5000～14000轉/分鐘下離心3～30分鐘，靶向肽結合的金納米顆粒被沉淀在離心管底部；然后再將納米顆粒超聲分散于水中，如此重復多次，洗凈靶向肽結合的金納米顆粒。

5.權利要求1或2或3所述的一種肝癌細胞靶向肽修飾的金納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備十六烷基三甲基溴化氨穩定的金納米顆粒：用十六烷基三甲基溴化氨作為軟性模板劑，采用種子生長法制備金納米顆?；蛘哂脵幟仕徕c作為還原劑制備金納米顆粒；

(2)制備靶向肽結合的金納米顆粒：向步驟(1)金納米顆粒溶膠，其在800nm左右處吸收值為1中加入肝癌細胞靶向肽1～5mg/ml反應；反應4～8小時后，通過離心的方法將沒有反應的肽去除，將反應液在5000～14000轉/分鐘下離心3～30分鐘，靶向肽結合的金納米顆粒被沉淀在離心管底部；然后再將納米顆粒超聲分散于水中，如此重復多次，洗凈靶向肽結合的金納米顆粒。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)金納米顆粒的制備：

金納米種子溶液的制備：稱取十六烷基三甲基溴化銨)溶于7.5ml水中，在熱水中使之完全溶解，然后冷卻至室溫，將硼氫化鈉(NaBH₄)溶于冰水中，配置成10毫摩爾/升濃度的溶液，在CTAB溶液中加入250μl的氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)溶液，輕微震蕩，迅速加入600μl新制備、冷凍的NaBH₄，超聲2分鐘排除氣泡，在37℃水中恒溫2小時以上；

CTAB穩定的金納米顆粒的制備：先稱量CTAB溶于水中，熱水浴使之完全溶解，然后冷卻至室溫，在溶好的CTAB溶液中依次加入鹽酸(HCl)、硝酸銀(AgNO₃)、氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)、抗壞血酸，搖勻為無色后，加入種子溶液，超聲2分鐘排除氣泡，放入37℃水浴過夜；

(2)靶向肽修飾的金納棒的制備

取肝癌細胞靶向肽溶于水中，加入納米金棒溶膠，緩慢升溫至55℃，恒溫水浴3小時后，室溫下輕微攪拌2小時，用6000轉/分鐘，10分鐘離心二次去除沉淀；

(3)帶熒光基團的靶向肽修飾的納米金棒

取羅丹明B，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，N-羥基丁二酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)溶于水中，避光放置20分鐘，加入靶向肽修飾的納米金棒溶液，避光攪拌反應24小時；

用離心機轉速6000轉/分鐘，離心時間10分鐘多次離心去除上清液并濃縮體積；

(4)細胞靶向實驗

I.復蘇

復蘇的細胞有肝癌細胞(HepG2細胞)，正常肝細胞(7702細胞)、人體肺腺癌上皮細胞(A549細胞)；從-80℃冰箱張取出凍存的細胞，溫水浴直至融化，用移液槍吸取細胞懸液，滴入10倍以上的培養液混勻后離心并去除上清液；接著用含有10％胎牛血清的培養液將細胞重懸并計數，調整密度，然后在培養瓶中接種，37℃進行培養，培養液每天更換一次；

II.靶向實驗

細胞靶向實驗選用對數生長期細胞2×10⁴個/ml接種在24孔板內，每孔100μl，培養24小時后更換新鮮的培養基，設置實驗組、對照組和空白組，實驗組加入不同濃度梯度的藥物，對照組不加入藥物，空白組沒有接種細胞且不加藥物，繼續培養4小時后除去培養基；

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100μl，鋪板使待測細胞調密度至10萬個/孔，邊緣孔用無菌磷酸緩沖液填充；5％CO₂，37℃孵育，培養12小時；第二天進行加樣，5％CO₂，37℃孵育4小時；棄去舊的培養基加入新鮮培養基100μl，用磷酸緩沖液(PBS)洗一次；每孔加入100μl消化液，使細胞裂解，消化結束后加入大量磷酸緩沖液置于1.5ml離心管中，用離心機轉速1500轉/分鐘、時間5分鐘進行離心，除去上清液；加入1ml磷酸緩沖液離心洗滌1次，棄去上清液，洗凈后加入0.5ml磷酸緩沖液，配置成懸浮液后使用流式細胞儀進行分析。