[發明專利]一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法

有效

• 申請號: 201410577132.0
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104263846A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 李忠虎;房敏峰;岳明;劉文哲;劉占林;趙鵬;趙桂仿
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 第五思軍

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法。

背景技術

物種的快速鑒定和識別是保護生物學和生物多樣性研究的基礎。然而，長期以來，人們對于植物物種的鑒定和識別主要依賴于物種間明顯的外部形態特征，如植物的花、果實、種子、根、莖和葉等。同時，還依賴于專業分類人員的實踐經驗和指導。然而，在當前傳統分類學專業人員急劇減少的情況下，基于物種外部形態特征的分類學鑒定方法，很難準確鑒定和識別物種間外部形態特征差異較小(尤其是物種間存在中間過渡形態性狀的時候)的近緣植物物種類群。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，尤其是DNA分子測序技術的飛速進步，DNA分子條形碼(DNA?Barcoding)技術被提出用來快速鑒定物種。這一方法主要是通過對一段標準目的DNA分子序列片段進行比對分析從而對相關物種進行快速鑒定。作為一種新型的物種鑒定手段，DNA條形碼技術自提出以來就被廣泛應用到很多近緣類群的物種鑒定方面，如哺乳動物、鳥類、昆蟲和魚類等。在這些動物類群中，線粒體細胞色素C氧化酶(COI)基因序列有著豐富的和物種特有的變異位點，被認為可以作為動物物種鑒別的核心DNA分子條形碼標記。然而，在植物類群中，由于線粒體基因較慢的進化速率，導致很難尋找到含有豐富變異的線粒體基因位點，這嚴重限制了線粒體基因標記在植物類群物種鑒定中的應用。鑒于此，國際生命條形碼聯盟(CBOL)和中國植物條形碼研究團隊(China?Plant?BOL?Group)通過對大量植物類群的多個葉綠體DNA片段的反復篩選和實驗研究，發現在被子植物中進化速率相對較快的葉綠體rbcL+matK基因標記組合以及核ITS基因片段有著豐富的變異位點，可以用來作為種子植物的核心DNA條形碼分子標記。另外，葉綠體trnH-psbA基因片段可以作為輔助條形碼標記，用于植物物種的DNA分子鑒定。

然而，對于裸子植物類群來說，由于葉綠體基因較慢的突變速率，加上裸子植物本身較長的世代周期(從種子發育到植株個體成熟到再次產生種子，大約需要15年左右的時間)和大的有效種群大小(數量)導致了葉綠體DNA條形碼rbcL+matK+trnH-psbA標記組合以及核ITS基因片段無法準確區分裸子植物近緣物種。這尤其表現在近期發生物種形成歷史的柏科刺柏屬物種上面，導致刺柏屬物種間葉綠體DNA片段以及核ITS基因片段基因位點間的大量共享，使得使用這些標準DNA條形碼分子標記組合很難準確鑒定和識別刺柏屬近緣物種。本發明擬找到一段能夠在刺柏屬物種中具有豐富變異位點的核基因引物進行區分和鑒定刺柏屬近緣物種。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，柏科刺柏屬物種由于具有大量相同的外部形態特征和一些中間過度形態，一般都為常綠喬木或灌木樹種；雌雄同株或異株；葉為刺葉或鱗葉，披針形或近條形；雄球花卵圓形或矩圓形，雌球花近圓球形；球果漿果狀，近球形；種鱗合生，肉質；種子1-6粒，無翅，常有樹脂槽，這導致了運用傳統的形態分類學鑒定方法很難快速準確的鑒別這些物種，同時，由于刺柏屬物種之間相對較近的物種形成和分化歷史和大的有效種群數量，使得利用單親遺傳、進化速率較慢的葉綠體DNA分子標記很難鑒別這些物種。研究發現，柏科刺柏屬物種在國際生命條形碼聯盟和中國植物條形碼研究團隊推薦使用的核心葉綠體DNArbcL+matK+trnH-psbA條形碼標記組合和核ITS基因片段上均存在大量的基因多態性共享，導致無法準確區分刺柏屬近緣物種。另外，以前的物種分子鑒定研究，大多一個物種取樣一個個體進行鑒定，導致一個物種在不同地方進行取樣時，由于近緣物種間的基因多態性共享或漸滲，可能使得親緣關系較近的物種具有相同的基因序列或變異，這給物種的準確鑒別帶來了極大困難，因此，本發明的目的是篩選出一種能夠在刺柏屬多個近緣物種中取樣多個個體，利用具有雙親遺傳特征、而且進化速率較快的核基因DNA分子條形碼標記，進行物種的快速和準確鑒別的方法；利用具有雙親遺傳特征、而且進化速率較快的核基因DNA分子條形碼標記，進行物種的快速和準確鑒別。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，能夠對刺柏屬近緣物種進行快速和準確鑒別的DNA分子條形碼標記，主要是利用一段雙親遺傳的核基因Chi1引物對刺柏屬近緣種不同個體的DNA樣品進行擴增和序列測定，從而進行序列比對分析以及系統進化樹的構建，進一步比較分析序列間的變異以及系統進化樹上不同物種個體的聚類情況來進行物種的快速鑒定；具體包括以下步驟：