[發明專利]一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法

有效

• 申請號: 201410577132.0
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104263846A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 李忠虎;房敏峰;岳明;劉文哲;劉占林;趙鵬;趙桂仿
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 第五思軍

1.一種快速鑒別刺柏屬近緣物種的分子方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、對采集的刺柏屬物種的干燥葉片或種子，使用CTAB法進行葉片總DNA或種子胚乳DNA的提取；具體程序如下：

1)取自然干燥的刺柏屬物種的一顆成熟種子，砸開外種皮；用蒸餾水侵泡種子10-24小時，用鑷子分離種子中單倍體的胚乳，保存于4℃的冰箱內；

2)研磨胚乳或粉碎葉片：對于分離的單倍體胚乳，放入事先預冷的研缽中，一顆種子的胚乳放到一起，加入適量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成細粉末；對于干燥葉片，直接用電子天平稱取0.02g，然后與不銹鋼珠一同放進2.0mL的離心管中，并在離心管中加入適量PVP粉末，一同置于組織研磨器以30Hz頻率打磨粉碎樣品3min，使其盡可能成為粉末；

3)粉末中加入800μL在65℃水浴中預熱的2×CTAB溶液和8μL的β-巰基乙醇，輕彈讓粉末完全混勻于2×CTAB溶液中，將離心管置于65℃水浴鍋中水浴45min，期間每隔10min上下顛倒混勻；

4)取出離心管，待溫度降到室溫，在12000rpm,4℃條件下離心10min；用剪掉頭的藍色槍頭吸取上清液置于新的2.0mL離心管中，然后加入800μL氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管10min，以進行雜質的抽提；

5)在轉速10000rpm、4℃條件下離心10min，轉移上層液體到新的2.0mL離心管中，并加入800μL氯仿-異戊醇溶液，上下顛倒混勻離心管10min；

6)在轉速10000rpm，4℃條件下離心10min，用移液器吸取上清液置于1.5mL的新離心管中，加入2倍體積的無水乙醇輕搖混勻，置于-20℃的冰箱中保存90min以上；

7)取出后在4℃，轉速12000rpm下離心10min，倒掉上層廢液，再用70％乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超凈工作臺上自然風干；

8)在離心管中加入60μL雙蒸水溶解DNA沉淀，用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和產量，置于4℃的冰箱內保存備用；

二、對檢測合格的DNA樣品，利用核基因Chi1引物進行PCR擴增和測序，

具體PCR擴增體系為25μL：包括2.5μL10×PCR?buffer，0.5μL25mmol/L?MgCl₂，5μmol/L正反向核基因Chi1引物各1.2μL，0.5μL10mmol/LdNTP，0.25μL5U/μLr-Tag?DNA聚合酶，10～50ng的模板DNA，充分混勻后，在普通PCR擴增儀上進行PCR擴增反應；

擴增程序為：先在94℃條件下預變性4分鐘，接著進行36個循環，包括在94℃條件下變性45秒，55℃條件下退火45秒，72℃條件下延伸2分30秒，最后72℃條件下終延伸10分鐘，擴增產物保存在4℃的冰箱內，用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的純度和產量；

三、PCR擴增產物的純化

使用純化試劑盒CASpure?PCR?Purification?Kit對PCR擴增產物進行純化：

1)在solution?Ⅱ中加入4倍體積的無水乙醇；

2)從PCR反應管中將反應產物移至干凈的1.5mL離心管中，加入5倍體積的solution?Ⅰ混合均勻，得到混合液；

3)將混合液轉移到一個已經套入2.0mL離心管的吸附柱內，室溫放置2min，在轉速10000rpm時離心1min；

4)重復步驟3)一次；

5)倒掉2.0mL離心管中的廢液，將吸附柱放入同一個2.0mL離心管中，于轉速10000rpm的條件下空柱離心2min；

6)將吸附柱放入一個干凈的1.5mL離心管中，于37℃時放置8-12min以確保乙醇完全揮發干凈；

7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30μL滅菌的雙蒸水進行洗脫，雙蒸水65℃預熱，室溫或37℃的水浴靜置1min以上；

8)轉速10000rpm的條件下離心1min，此1.5mL離心管中的液體即為回收的DNA片段，用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測純化產物的純度和產量，于4℃條件下保存備用；

四、對純化產物進行測序反應

純化后的產物，用與PCR擴增時相同的引物進行測序反應，在普通PCR擴增儀上進行，10μL的反應體系包括：Big?Dye?Terminator(ABI)2.5μL，正向或反向核基因Chi1引物5pmol，純化后的模板產物25-50ng，測序反應的條件如下：

首先95℃條件下預變性8秒，接著進行25個循環，包括95℃條件下變性15秒，50℃條件下退火15秒，60℃條件下延伸90秒，最后60℃條件下終延伸90秒，測序反應的產物保存在4℃的冰箱內；

五、測序反應產物的進一步純化

測序反應的產物按如下步驟進行純化：

1)加入25μL的醋酸鈉，避光室溫放置30min，在25℃、轉速4000rpm的條件下離心30min；

2)離心結束后立即倒扣離心，轉速不超過500rpm；

3)加入35μL的75％乙醇，立即在25℃、轉速4000rpm的條件下離心15min；

4)離心結束后立即倒扣離心，轉速不超過500rpm；

5)加入40μL的75％乙醇，立即在25℃、轉速4000rpm的條件下離心15min；

6)離心結束后立即倒扣離心，轉速不超過500rpm；

7)37℃的烘箱烘干半小時以上；

8)取出后加入10μL甲酰胺；

9)變性上機：95℃條件下變性5min，取出后快速放于冰上冷凍10min；

10)純化產物保存于4℃的冰箱內，待上機收集數據；

六、純化產物利用遺傳分析儀進行數據收集；或者對于Chi1基因擴增的PCR產物，利用遺傳分析儀進行測序和數據的收集；

七、測序得到的原始序列峰圖用Chromas軟件打開，并對測序質量高的個體讀取堿基數據信息；然后利用MEGA?ver.6.0軟件進行序列比對和校正；鑒定出刺柏屬近緣物種小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)Chi1基因的序列：

小子圓柏#292-1-JM

CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTT

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小子圓柏#292-2-JM

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方枝圓柏#270-1-JS

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方枝圓柏#061-4-JS

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西藏圓柏#183-1-JT

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西藏圓柏#222-2-JT

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TTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTC

AATA；

八、分析和比對序列之間的差異程度，進行刺柏屬小子圓柏(JM)、方枝圓柏(JS)和西藏圓柏(JT)的物種鑒定；

由序列比對和分析可以看出，刺柏屬三個近緣物種在Chi1基因序列上存在明顯的遺傳差異，相互之間能夠區分，方枝圓柏(JS)的兩個個體270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置處存在著特有的基因變異位點；小子圓柏(JM)的兩個個體292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置處存在著特有的變異位點；而西藏圓柏(JT)的兩個個體183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp處存在特有的基因變異，這些特有的基因變異位點使得三個刺柏屬物種之間能夠準確區分；

利用MEGA?ver.6.0軟件基于距離法進行系統進化樹的構建，由系統進化關系樹可得知，每個刺柏屬物種的個體能夠單獨聚到一個獨立的遺傳分支上，對應于該物種本身，使得這些物種之間能夠準確區分。