[發(fā)明專利]蛋白質表面重建

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410575610.4
• 申請日: 2007-06-01
• 公開（公告）號: CN104356230A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設計）人: 大衛(wèi)·R·劉;凱文·約翰·菲利普斯;邁克爾·S·勞倫斯
• 申請（專利權）人: 哈佛大學校長及研究員協(xié)會
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K19/00;C07K14/435;C07K14/36;C12N15/12;C12N15/31;C12N9/10;C12N15/54;A61K38/17;A61K38/16;A61K38/45
• 代理公司: 北京律盟知識產權代理有限責任公司 11287
• 代理人: 林斯凱

本申請是申請日為2007年6月1日、申請?zhí)枮?00780027139.3、發(fā)明名稱為“蛋白質表面重建”的發(fā)明專利申請的分案申請。

相關申請案

本申請案根據35U.S.C.§119(e)主張2006年6月2日申請的美國臨時專利申請案USSN?60/810,364的優(yōu)先權，其全部內容以引用的方式并入本文中。

政府支持

本文中所述的研究部分得到美國國立衛(wèi)生研究院(National?Institutes?of?Health)基金(GM065400)的支持。美國政府可具有本發(fā)明的某些權利。

技術領域

無

背景技術

蛋白質是細胞的主要組成成分。蛋白質催化化學反應，在生物系統(tǒng)中轉導信號，在細胞和細胞外基質中提供結構元件，充當信使等。蛋白質不良表現(xiàn)的主要原因之一是聚集。這不僅是實驗室中的問題，而且是諸如阿爾茨海默病(Alzheimer's?disease)等許多疾病的問題。在達到計算設計的蛋白質時，聚集是尤其煩惱的問題。舉例來說，TOP7是具有新穎折疊的計算設計的蛋白質。TOP7的較長形式(延長的TOP7(TOP7extended))極易聚集。TOP7ex主要表達為不可溶的聚集體。

隨著更多蛋白質被設計或修飾以用作研究生物系統(tǒng)的工具或隨著更多野生型或修飾蛋白質被用作治療劑，需要常規(guī)上將這些蛋白質修飾為更穩(wěn)定和/或防止聚集的系統(tǒng)。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供一種修飾蛋白質以使其更穩(wěn)定的系統(tǒng)。本發(fā)明的產生是基于對修飾蛋白質表面上的疏水性區(qū)域可提高蛋白質的超熱力學性質的認識。本發(fā)明系統(tǒng)尤其適用于提高所關注蛋白質的溶解性，提高蛋白質的抗聚集性，和/或提高蛋白質的復性能力。所有這些特性尤其適用于蛋白質生產、蛋白質純化以及使用蛋白質作為治療劑和研究工具。

在一方面，本發(fā)明提供一種改變蛋白質的一級序列以增加寬范圍條件下蛋白質的抗聚集性、溶解性、重折疊能力和/或總體穩(wěn)定性的方法。修飾蛋白質的活性優(yōu)選大致或大體上與未修飾的蛋白質相同。在某些實施例中，修飾蛋白質保留至少50％、75％、90％或95％的野生型蛋白質的活性。在一實施例中，所述方法包括以下步驟：(a)鑒別所關注蛋白質的表面殘基；(b)鑒別特定表面殘基在與所關注蛋白質相關的其它蛋白質中是非高度保守的(即，確定哪些氨基酸對蛋白質活性或功能來說不是不可缺少的)；(c)確定所鑒別的非保守表面殘基的疏水性；以及(e)用在生理pH值下極性更高或帶電的氨基酸置換至少一個或一個以上所鑒別的疏水性非保守殘基。各以上步驟均可以使用所屬領域中已知的任何技術、計算機軟件、算法、范式等進行。產生修飾蛋白質后，可測試其活性和/或所尋求的預期性質。在某些實施例中，修飾蛋白質更加穩(wěn)定。在某些實施例中，修飾蛋白質不易聚集。本發(fā)明方法通常增加在生理pH值下蛋白質的凈電荷(正或負)。

在另一方面，本發(fā)明提供一種通過使蛋白質“超帶電(supercharging)”來改變蛋白質的一級序列以增加寬范圍條件下蛋白質的抗聚集性、溶解性、重折疊能力和/或總體穩(wěn)定性的方法。也就是說，與野生型蛋白質相比，修飾蛋白質上總的凈電荷增加(正電荷或負電荷)。修飾蛋白質的活性優(yōu)選大致或大體上與未修飾的蛋白質相同。在某些實施例中，所述方法包括以下步驟：(a)鑒別所關注蛋白質的表面殘基；(b)鑒別特定表面殘基在與所關注蛋白質相關的其它蛋白質中是非高度保守的(即，確定哪些氨基酸對蛋白質活性或功能來說不是不可缺少的)；(c)確定所鑒別的非保守表面殘基的親水性；以及(e)用在生理pH值下帶電的帶電氨基酸置換至少一個或一個以上所鑒別的帶電或極性、溶劑暴露非保守殘基。在某些實施例中，為制備帶負電的“超帶電”蛋白質，使所鑒別用于修飾的殘基突變?yōu)樘於彼?Asp)或谷氨酸(Glu)殘基。在某些其它實施例中，為制備帶正電的“超帶電”蛋白質，使所鑒別用于修飾的殘基突變?yōu)橘嚢彼?Lys)或精氨酸(Arg)殘基。各以上步驟都可以使用所屬領域中已知的任何技術、計算機軟件、算法、范式等進行。產生修飾蛋白質后，可測試其活性和/或所尋求的預期性質。在某些實施例中，修飾蛋白質(“超帶電蛋白質”)更加穩(wěn)定。在某些實施例中，修飾蛋白質不易聚集。本發(fā)明方法通常增加在生理pH值下蛋白質的凈電荷(正或負)。