[發明專利]一種高特異性的利巴韋林人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 201410573952.2
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN104387431A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 匡華;彭雙;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07H19/056
• 分類號: C07H19/056;C07H1/00;C07K14/765;C07K14/795;C07K14/77;C07K16/44;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種高特異性的利巴韋林人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

利巴韋林為抗病毒藥物，是廣譜強效的抗病毒藥物，由于其毒副作用強，易引起免疫系統損傷和致畸。早在2005年農業部就明確規定禁止利巴韋林等抗病毒獸藥的銷售和使用。

2012年底媒體曝出了“速生雞”事件，某些肉雞養殖企業違反國家獸藥管理條例，在養殖過程中喂食利巴韋林等人用抗病毒藥品，引起了人們極大的關注。目前我國對于動物源性食品中利巴韋林殘留量檢測的相關研究報道甚少，更未制定或立項國家標準和行業標準，國際上也無特定限量要求及相應檢測方法。因此，建立快速檢測利巴韋林在動物組織中殘留量的方法已迫在眉睫。

利巴韋林的化學結構式如式I所示。

?

(式I),

目前我國對利巴韋林的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用法（LC/MS）等。儀器分析方法存在樣品須經多步稀釋、過濾、提取，制備復雜、繁瑣的缺點。盡管儀器方法是利巴韋林檢測的確證方法，但是由于其操作繁瑣，以及長時間的樣本前處理過程，導致檢測成本高，周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查，以及現場快速檢測的要求。ELISA和膠體金試紙條法屬于免疫分析技術，具有較高的靈敏度和特異性，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。

本發明的半抗原是在利巴韋林分子的5-號位羥基一端接出活性羧基，得到單一特異性結構的利巴韋林羧基衍生物，該衍生物為利巴韋林半抗原，將半抗原與載體蛋白偶聯最后形成完全抗原。

發明內容

本發明的目的：針對現有利巴韋林抗原合成技術的空白，提供一種新型的利巴韋林半抗原和完全抗原合成方法，使得制備高特異性的利巴韋林單克隆抗體成為可能。

本發明提供的利巴韋林半抗原化合物，具有式Ⅱ所示分子結構。

本發明的技術方案：

合成路線及方案如下：一種利巴韋林半抗原，其分子結構式如式Ⅱ所示

（式Ⅱ），

利巴韋林半抗原合成反應方程式為：

其是由利巴韋林為原料，在利巴韋林分子的5-號位羥基一端接出活性羧基，得到單一特異性結構的利巴韋林羧基衍生物，該衍生物為利巴韋林半抗原。

一種利巴韋林完全抗原，是所述利巴韋林半抗原與載體蛋白的偶聯物。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、匙孔血藍蛋白KLH、血藍蛋白LPH、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS中的一種。

所述的利巴韋林半抗原的制備方法，包括如下步驟：100mg利巴韋林溶解于5mL無水DMF和5mL無水吡啶的混合液中，加入50mg琥珀酸酐后，60℃水浴反應12h，最后于pH3酸性條件0℃下重結晶生成利巴韋林半抗原。

所述的利巴韋林完全抗原的制備方法，包括如下步驟：

（1）將利巴韋林半抗原，用超純水溶解，與NHS，EDC按摩爾比為1:?2:?2混合，在室溫25℃下攪拌反應12h進行活化；取牛血清蛋白，利巴韋林半抗原與牛血清蛋白的摩爾比為80:1，用0.1M?pH9.6?碳酸鹽緩沖液溶解，其中溶解后的蛋白濃度大于3mg/mL；將活化的利巴韋林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室溫下反應24h，用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到利巴韋林完全抗原；

或（2）將利巴韋林半抗原，用超純水溶解，與三正丁胺,?氯甲酸異丁酯按摩爾比為1:?1.5:?1.5混合,??0℃反應1h進行活化；取牛血清蛋白，利巴韋林半抗原與牛血清蛋白的摩爾比為60:1，用?0.1M?pH9.6?碳酸鹽緩沖液溶解，0℃預冷30min，其中溶解后的蛋白濃度大于3mg/mL；在0℃條件下，將活化的利巴韋林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃條件下反應1h，然后室溫下反應24h；用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到利巴韋林完全抗原。

所述利巴韋林完全抗原的制備方法，所述載體蛋白牛血清白蛋白BSA被替換為匙孔血藍蛋白KLH、血藍蛋白LPH、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS之一種。

所述利巴韋林完全抗原的應用，在制備利巴韋林抗體中的應用，免疫動物得到抗體。

所述抗體為多克隆抗體和/或單克隆抗體。

所述抗體在檢測利巴韋林中的應用。

得到的利巴韋林完全抗原，將利巴韋林完全抗原透析，然后進行丙烯酰胺凝膠電泳鑒定（圖1）。