[發明專利]一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法和用途及其藥效驗證方法

在審

• 申請號: 201410573326.3
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104383557A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 劉平;胡國良;郭小權;曹華斌;張彩英;劉佩;侯小露;黃云飛
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12Q1/68;G01N33/68;C12Q1/02;A61P11/00;A61P9/00;A61P7/10
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技術領域

本發明涉及基因治療技術領域，具體是一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的研制方法。

背景技術

肉雞腹水綜合征(ascites?syndrome，AS)又稱肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonary?hypertension?syndrome，PHS)，是在各種因素作用下造成肉雞相對缺氧或肉雞生長過快，肺的容積與體重的增加不成正比，在此情況下，由于氧無法滿足機體的正常需要，致使其呈現血液黏稠、血容量增加、肝腫大、肺瘀血水腫及肺動脈高壓等病理現象，這種在臨床上以腹腔積液和右心室肥大、擴張等為主要特征，被視為一種營養代謝病，也是公認的嚴重危害肉雞養殖業的疾病之一。該病以肉雞多發，冬季和早春易發，且分布范圍廣。北美、玻利維亞、秘魯、墨西哥、南非、英國、美國、澳大利亞、德國、加拿大、意大利、日本等國家。近年來全球對AS調查發現，其發病率達10％～40％，呈上升趨勢，平均發病率為4.2％，年死亡率超過25％，每年約有70億只肉雞受到腹水綜合征的侵害，經濟損失高達100億美元。顯然該病業已成為嚴重危害肉雞養殖業發展的全球性問題。

自從肉雞AS報道以來，不斷有國內外學者對其病因進行了大量的研究，他們認為大多數肉雞AS的誘發原因主要源于生長過快、組織缺氧、飼養密度過高、海拔過高、溫度過低、高鈉日糧及低硒日糧、低磷、低VC、VE等因素。其原因是這些誘因均可引起機體相對性缺氧，而對氧的消耗量已超過其心肺功能供氧的極限臨界點，以致于機體處于缺氧狀態，最終導致肺動脈高壓而形成腹水。

近年來，有關HIF-1α與肉雞AS的研究也有些許報道，曾秋鳳等采用RT-PCR技術檢測正常肉雞和AS患雞肺臟HIF-1αmRNA，結果表明，AS患雞肺臟HIF-1αmRNA表達豐度極顯著高于正常肉雞(P＜0.01)，揭示了HIF-1α與腹水綜合征高度相關性。Zhang等證明了肉雞食用高鹽的飲水可以增加HIF-1αmRNA表達，引起肉雞腹水發生。Toshiyuki等對雞胚心室肌細胞中HIF-1α基因進行了cDNA克隆，得到了HIF-1α基因全長cDNA序列等。但是利用阻斷HIF-1α基因在肉雞AS治療上還未見相關研究，因此，抑制HIF-1α的活性為治療肉雞AS提供了新靶點。目前，RNA干擾HIF-1α基因的國內外研究主要在哺乳動物和人的研究較多，在腫瘤疾病中治療，如Wang等通過HIF-1α-shRNAi轉染到人乳腺癌細胞中，發現HIF-1α與VEGF基因表達量分別下降了91.63％、66.8％，從而抑制乳腺癌細胞的生長。Zhou等應用RNA干擾HIF-1α將有效地抑制口腔鱗狀細胞癌的發展，特別是抑制和預防癌癥細胞的血管生成和生存，因此，它可以作為一種強有力的和特定的治療口腔癌。Chen等利用RNA干擾HIF-1α在小鼠腫瘤研究中，發現HIF-1α和血管內皮生長因子的表達明顯減少，抑制腫瘤血管生成和減毒轉移，顯著抑制腫瘤的生長。Min等在人肺腺癌多藥耐藥細胞的RNA干擾HIF-1α實驗中發現多藥耐藥基因及蛋白顯著減少。此外，RNA干擾還在肝、呼吸系統及眼科等疾病中也得到廣泛應用。以上RNA干擾HIF-1α基因的研究成果為本發明探索RNA干擾HIF-1α基因對肉雞腹水的形成機理提供了非常重要的思路。

綜上所述，肺動脈高壓是對適應缺氧反應時機體的一種表現，同時在許多疾病中也是一種重要的病理生理癥狀。目前的研究發現，HIF-1α是調控肺動脈高壓的中心環節。

發明內容

本發明的目的在于提供一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的研制方法，本發明利用RNA干擾技術來阻斷HIF-1α基因在肉雞PAEC/肉雞AS中有效作用。主要通過檢測HIF-1α、ET-1、VEGF基因表達及生理生化指標情況，進一步研究參與低氧環境中PAEC增殖與凋亡的作用機制等，并更深入地從分子水平上闡明RNA干擾HIF-1α在肉雞AS發生作用機制，將可能為臨床肉雞AS的預防和治療提供一種新的途徑和方法。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，首先構建慢病毒表達載體-HIF-1α-shRNAi，然后將HIF-1α-shRNAi重組質粒包裝成藥劑，即為治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物。

作為本發明進一步的方案：HIF-1α-shRNAi的慢病毒表達載體的構建：采用DNA重組技術將HIF-1α-RNAi雙鏈定向亞克隆入PU6啟動子即可。