[發(fā)明專利]一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法和用途及其藥效驗證方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410573326.3
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104383557A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉平;胡國良;郭小權(quán);曹華斌;張彩英;劉佩;侯小露;黃云飛
• 申請（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12Q1/68;G01N33/68;C12Q1/02;A61P11/00;A61P9/00;A61P7/10
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1.一種治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，其特征在于，首先構(gòu)建慢病毒表達載體-HIF-1α-shRNAi，然后將HIF-1α-shRNAi重組質(zhì)粒包裝成藥劑，即為治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，其特征在于，HIF-1α-shRNAi的慢病毒表達載體的構(gòu)建：采用DNA重組技術(shù)將HIF-1α-RNAi雙鏈定向亞克隆入PU6啟動子即可。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的制備方法，其特征在于，所述HIF-1α-shRNAi的慢病毒表達載體的構(gòu)建：采用pGCSIL-GFP載體，轉(zhuǎn)染細胞為293T細胞。

4.一種如權(quán)利要求1或2所述的制備方法制備的治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物的應(yīng)用，其特征在于，將治療肉雞腹水征合癥的RNA干擾藥物注射到粒肉雞體內(nèi)，沉默HIF-1α基因，抑制下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、體內(nèi)內(nèi)皮素-1(ET-1)、胰島素樣生長因子II(IGF-II)的表達。

5.一種如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用的藥效驗證方法，其特征在于，包括：(1)RNA干擾HIF-Iα基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗和(2)RNA干擾HIF-1α基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗；

步驟(1)RNA干擾HIF-1α基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗，具體包括：(1.1)鑒定RNA干擾靶點是否成功連接到慢病毒載體；(1.2)HIF-1α-shRNAi細胞轉(zhuǎn)染；(1.3)模擬缺氧實驗；(1.4)細胞的爬片與DAPI染色；(1.5)HIF-1a、VEGF、ET-1基因表達量的檢測；

步驟(2)RNA干擾HIF-1α基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗，具體包括：(2.1)人工誘導(dǎo)肉雞腹水征合癥試驗；(2.2)動物分組；(2.3)動物接種；(2.4)檢測。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(1.2)HIF-1α-shRNAi細胞轉(zhuǎn)染是借助Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染細胞，篩選出最佳的干擾靶點。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(2.1)人工誘導(dǎo)肉雞腹水征合癥試驗是采用三利用環(huán)境低溫、飼料添碘甲狀腺原氨酸(T3)誘發(fā)肉雞腹水征合癥。

8.根據(jù)權(quán)利要求5-7之一所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(1)RNA干擾HIF-1α基因?qū)θ怆uPAEC生長實驗：通過RNA干擾技術(shù)、細胞轉(zhuǎn)染進行分組實驗，利用RT-PCR、熒光定量PCR、Western?Blot流式細胞儀檢測方法對HIF-1α、VEGF、ET-1基因表達進行檢測以驗證RNA干擾HIF-1α基因在肉雞PAEC中的效果。

9.根據(jù)權(quán)利要求5-7之一所述的藥效驗證方法，其特征在于，步驟(2)RNA干擾HIF-1α基因在肉雞體內(nèi)對腹水形成實驗：擇用正常肉雞和人工誘導(dǎo)的腹水征合癥肉雞為實驗對象，采用RNA干擾技術(shù)進行肉雞體內(nèi)實驗，以測定肉雞中右心室重與全心室重的比值(RV/TV)、紅細胞總數(shù)(PCV)、紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)指標(biāo)，從而分析RNA干擾HIF-1α對肉雞腹水發(fā)病過程中生理生化指標(biāo)的變化；與此同時，再通過RT-PCR、實時熒光定量PCR、Western?Blot、免疫組化方法檢測各組織中的HIF-1α、VEGF、ET-1基因mRNA的表達情況；最終結(jié)合以上實驗結(jié)果，驗證肉雞體內(nèi)RAN干擾HIF-1α對肉雞腹水形成的影響。