[發明專利]一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體

有效

• 申請號: 201410568323.0
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104371993B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發明（設計）人: 劉松;馮岳;陳堅;堵國成;陳雙全;王廣圣;陳璇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/82
• 分類號: C12N9/82;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體，屬于酶工程領域。?

背景技術

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH₃。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現為對某些腫瘤的抑制作用，尤其對急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物，對骨髓細胞沒有抑制作用。?

L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過程中通過美拉德反應生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。?

一些微生物、哺乳動物及植物被證實含有L-天冬酰胺酶。因為動物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工藝復雜，微生物具有易培養，成本低等優點，成為學者研究的重點，目前研究的產L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia?coli、Erwinia?carotovora、Erwinia?chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶產量低，近年來利用基因工程技術將L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天冬酰胺酶的高效表達，利用工程菌產L-天冬酰胺酶已成為一個重要來源。?

L-天冬酰胺酶有兩種類型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichiacoli、Erwinia?chrysanthemi、B.subtilis等均包含這兩種L-天冬酰胺酶，研究證實僅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，來自Escherichia?coli和Erwinia?chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被開發為治療急性淋巴細胞白血病的有效藥物，目前研究的大部分是具有抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。?

本發明通過定點突變改變蛋白質分子內部的疏水性，從而進一步提高天冬酰胺酶酶活。?

發明內容

本發明所要解決的問題是提供一種酶活力提高的天冬酰胺酶突變體，所述突變是對氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的來源于枯草芽孢桿菌的天冬酰胺酶蛋白質內部氨基酸進行定點突變，從而提高了天冬酰胺酶的活性。?

所述突變是將天冬酰胺酶第133位的天冬酰胺分別突變為酪氨酸或色氨酸，得到突變體N133Y、N133W；或將143位的纈氨酸突變為異亮氨酸，得到突變體V143I；或在將143位的纈氨酸突變為異亮氨酸的同時，將第133位的天冬酰胺分別突變為色氨酸或酪氨酸，得到?突變體N133W/V143I、N133Y/V143I。?

天冬酰胺酶突變體N133Y、N133W、V143I、N133W/V143I、N133Y/V143I的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.2-6所示。?

本發明解決的另一個技術問題是提供構建所述突變體的方法，是通過定點突變技術將天冬酰胺酶蛋白質分子內部第133位的天冬酰胺分別突變為酪氨酸、色氨酸；或將143位的纈氨酸突變為異亮氨酸；或在將143位的纈氨酸突變為異亮氨酸的同時，將第133位的天冬酰胺分別突變為酪氨酸或色氨酸。?

在本發明的一種實施方式中，將含有編碼天冬酰胺酶的基因與載體pET22b(+)連接，轉化大腸桿菌E.coli?rosetta。挑選轉化子接種到LB液體培養基中，37℃培養12h，轉接到TB培養基中，接種量為3％。菌體長到OD₆₀₀為1.5時，加入IPTG誘導，并將培養溫度降到30℃，培養24h。收集發酵上清，純化獲得天冬酰胺酶突變體。?

本發明還提供一株天冬酰胺酶分泌能力增強的大腸桿菌，是將含有編碼天冬酰胺酶的基因與表達載體連接后轉化大腸桿菌。?

在本發明的一種實施方式中，將含有編碼天冬酰胺酶的基因與載體pET22b(+)連接，轉化大腸桿菌E.colirosetta。?

本發明還提供一種提高天冬酰胺酶活力的方法，是將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的天冬酰胺酶蛋白質分子內部第133位的天冬酰胺分別突變為酪氨酸、色氨酸；或將143位的纈氨酸突變為異亮氨酸；或在將143位的纈氨酸突變為異亮氨酸的同時，將第133位的天冬酰胺分別突變為酪氨酸或色氨酸。?