[發(fā)明專利]一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410568277.4
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104312935B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 康振;陳堅;堵國成;王淼;劉葉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/58;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/73
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，屬于代謝工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過在酵母中表達肌醇?1?磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，實現(xiàn)葡萄糖醛酸的生成途徑，同時表達來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脫氫酶(Udh)，成功構(gòu)建了葡萄糖二酸的合成途徑。其中，重組畢赤酵母在YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中生成葡萄糖二酸40mg/L，在YPD?MI(YPD培養(yǎng)基中加入60mM肌醇)發(fā)酵培養(yǎng)基中生成葡萄糖二酸60mg/L。本發(fā)明提出的重組酵母發(fā)酵生成葡萄糖二酸的方法，具有廣闊的發(fā)展前景，為生物合成葡萄糖二酸奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，屬于代謝工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

葡萄糖二酸(glucuric acid，saccharic acid)又名葡萄糖質(zhì)酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羥基均被氧化成羧酸(如硝酸作用)而形成的糖酸。熔點125～126℃，溶于水和乙醇，稍溶于乙醚，是β葡萄糖醛酸酶的抑制劑。

葡萄糖二酸及其衍生物在一些植物及哺乳動物中均有發(fā)現(xiàn)，特別是在一些十字花科蔬菜、草莓和柑橘類水果中含量豐富。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美國能源部確定為“最有價值的生物煉制產(chǎn)品”。它可以降低膽固醇、用于癌癥的治療，同時其鈣鹽也是一種食品添加劑。葡萄糖二酸在水溶液中不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟嵌醿?nèi)酯的形式，二者在水溶液處于互變平衡狀態(tài)。葡萄糖二酸1,4內(nèi)酯也是一種重要的功能產(chǎn)品，它可使肝素、透明質(zhì)酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破壞大大減少，幫助身體有效的排除毒素，并能夠緩解關(guān)節(jié)炎、痛風、氣喘和相關(guān)組織功能下降所引起的其他不適。

葡萄糖二酸由于對人體無毒，并且其結(jié)構(gòu)域單糖結(jié)構(gòu)相似，可以通過糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入細胞內(nèi)部，能夠在病灶部位聚集，并少量被缺血組織快速吸收，因此可以作為顯像劑應(yīng)用于心肌梗死和腫瘤的研究中。同時，葡萄糖二酸也可用作聚合物的組成部分，比如新型尼龍和超支化聚酯。葡萄糖二酸已成功利用在生產(chǎn)羥化尼龍上，這種材料是一種環(huán)保型的可生物降解的新材料。

目前葡萄糖二酸的制備方法主要為化學法，如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)為催化劑的共催化氧化等。硝酸氧化法主要是以葡萄糖為原料，通過硝酸氧化為葡萄糖二酸及其小分子物質(zhì)。此種方法生成的產(chǎn)物較多，副產(chǎn)物復雜，同時產(chǎn)生大量氣體，其反應(yīng)廢液對環(huán)境產(chǎn)生污染，因此逐漸被新方法取代。

2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)氧化體系是近年來發(fā)展起來的一種新的方法，TEMPO屬于亞硝酰自由基，是一種穩(wěn)定的自由基，其氮氧自由基通過不成對電子在氮氧之間移動形成了共振結(jié)構(gòu)。TEMPO氧化體系對糖類伯羥基的氧化選擇性高、反應(yīng)條件溫和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水溶液易形成葡萄糖1，4-內(nèi)酯及葡萄糖6,3-內(nèi)酯，所以在制備過程中以制得單鉀鹽為最終產(chǎn)物。此方法所用TEMPO可回收利用，產(chǎn)物純化容易，便于操作，是目前常用的一種方法。但是由于反應(yīng)過程中的反應(yīng)溫度及pH不易控制，因此仍然需要改進。

由于化學法所存在的局限較多，通過生物法來制備葡萄糖二酸越來越受到研究者的關(guān)注。葡萄糖二酸是存在于哺乳動物的代謝途徑中，它與抗壞血酸是葡萄糖醛酸代謝途徑的終產(chǎn)物。然而，從D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反應(yīng)。Prather等通過重組大腸桿菌，分別從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和小鼠體內(nèi)獲取肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)，從丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)獲得醛酸脫氫酶基因，克隆到大腸桿菌中，實現(xiàn)了葡萄糖二酸的生物合成。

酵母是單細胞低等真核生物，既有原核生物細胞容易培養(yǎng)、生長速度快、操作簡單，又具有真核生物表達時對蛋白質(zhì)的加工和修飾等功能。由于它培養(yǎng)時營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價、可進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，因此是一種可用于生產(chǎn)目標生物產(chǎn)品的優(yōu)良宿主。