[發明專利]一種構建重組酵母發酵生產葡萄糖二酸的方法

有效

• 申請號: 201410568277.4
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104312935B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;堵國成;王淼;劉葉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/58;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/73
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

1.一種重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌同時表達肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脫氫酶基因Udh；所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脫氫酶基因Udh的氨基酸序列分別是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3所示的序列；所述重組酵母菌的出發宿主菌為畢赤酵母；所述肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇加氧酶基因及醛酸脫氫酶基因為整合表達；所述重組酵母菌的構建方法包括如下步驟：(1)在Udh基因前融合GAP啟動子構成融合片段，連接到表達載體后轉化到酵母宿主菌中，得到重組菌；(2)將MIOX基因、組成型啟動子TEF、Ino1基因按順序融合，連接到表達載體上再轉化到步驟(1)得到的重組菌中。

2.一種權利要求1所述重組酵母菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在Udh基因前融合GAP啟動子構成融合片段，連接到表達載體后轉化到酵母宿主菌中，得到重組菌；(2)將MIOX基因、組成型啟動子TEF、Ino1基因按順序融合，連接到表達載體上再轉化到步驟(1)得到的重組菌中。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括：(1)Pichia pastorisGS115/Udh的構建：以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的基因組為模板擴增Udh基因，以pGAPZB質粒為模板擴增GAP啟動子，將GAP啟動子與Udh基因融合成上下游分別引入了酶切位點SacI、NotI的融合片段，并連接到表達載體pPIC9K上，篩選獲得正確的重組質粒，命名為pPIC9K-GAP-Udh，將重組質粒轉化到宿主Pichia pastoris GS115中即得到Pichiapastoris GS115/Udh；(2)以Pichia pastoris GS115基因組為模板擴增MIOX基因、Ino1基因，以pGAPZB質粒為模板擴增畢赤酵母組成型啟動子TEF，將MIOX、TEF、Ino1按順序融合，并在融合片段兩端添加XhoI，XbaI酶切位點，將融合片段連接到表達載體pGAPZB后，用BspHI線性化后電轉入步驟1構建的表達宿主Pichia pastoris GS115/Udh中，篩選正確的重組酵母菌，命名為Pichia pastoris GS115/Udh-MTI。

4.一種利用權利要求1所述重組酵母菌生產葡萄糖二酸的方法，其特征在于，是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇為底物催化合成葡萄糖二酸。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具體是將重組酵母菌種子液以5％-10％的接種量接種到發酵培養基中，于25℃-30℃，180rpm-220rpm，培養24h-96h。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的碳源為葡萄糖和/或肌醇。