[發(fā)明專利]一種犬干擾素α融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410568273.6
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104388452A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊芳;黃靜;潘盈盈;譚士明;嚴(yán)文娟;陳亞州;吳自榮
• 申請（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;A61K38/21;A61P31/12;C12N15/70
• 代理公司: 上海麥其知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗病毒活性的犬干擾素α融合蛋白及其核酸序列及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

干擾素(interferon，INF)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，因其具有干擾病毒的感染和復(fù)制功能而得名。其中，干擾素α因其廣譜的生物學(xué)功能而被廣泛應(yīng)用和研究。1986年，美國國家食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)重組α干擾素治療人毛細(xì)胞白血病，此后，重組INFα又被批準(zhǔn)治療艾滋病患者發(fā)生的Kaposi’s肉瘤、慢性髓樣白血病、濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、丙型肝炎、乙型肝炎等疾病[金伯泉，醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：61.]。犬是人類忠實的朋友。根據(jù)犬的用途，可分為寵物犬和實用犬，實用型的犬有實驗犬、導(dǎo)盲犬、警犬等。無論哪一種，均是人類生活和工作上的好伙伴。但是隨著飼養(yǎng)量的增加，犬病，特別是病毒病的發(fā)病率不斷升高，常常導(dǎo)致犬的死亡，給人類造成精神和經(jīng)濟上的損失。犬的3大烈性病毒病，包括狂犬病、犬細(xì)小病毒病和犬溫?zé)岵?，致死率均非常高[王紅.犬α干擾素的表達及其治療犬病毒性腸炎臨床療效觀察[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.]。犬干擾素α由于其抗病毒活性而在治療犬的病毒病方面有很大的前景。

傳統(tǒng)的生產(chǎn)干擾素α的方法是用人工方法在動物機體外或體內(nèi)，在干擾素誘生劑誘導(dǎo)下產(chǎn)生干擾素α。由于動物產(chǎn)生的干擾素α很微量[王紅，犬α干擾素的表達及其治療犬病毒性腸炎臨床療效觀察[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.]，傳統(tǒng)方法產(chǎn)生的干擾素α無法滿足需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程表達干擾素α成為可能。從1987年Adolf?Himmler第一個克隆出犬干擾素α的基因[Adolf?Himmler，Rudolf?Hauptmann，etc.Structure?and?expression?in?Escherichia?coli?of?Canine?Interferon-αgene[J].Journal?of?interferon?research，1987，7：173-183.]后，國內(nèi)外陸續(xù)有關(guān)于基因工程克隆表達犬干擾素α的研究報道[Taira，O，etc.Cloning?and?expression?of?Canine?interferon-αgenes?in?Escherichia?coli[J].Immunology，2005，67(10)：1059-1062.項黎麗等，犬α干擾素的克隆、表達及純化[J].中國動物檢疫，2010，1：35-38.]。

但干擾素α在大腸桿菌中多以包涵體形式存在，幾乎無活性，需要經(jīng)過變性復(fù)性的過程來獲得具有活性的蛋白質(zhì)[李桂偉.犬α干擾素的基因工程研究進展[J].黑龍江水產(chǎn)，2012，1：38-39]。復(fù)性過程時間長，需要大量的化學(xué)試劑，提高了成本。并且犬干擾素α中含有多個二硫鍵，增加了復(fù)性成功的困難。所以不需要復(fù)性的可溶的蛋白是降低工業(yè)成本的關(guān)鍵。

現(xiàn)有技術(shù)中，為提高外源蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中表達的可溶性，通常采用基因工程技術(shù)將目標(biāo)蛋白與一些分子伴侶蛋白相融合。該方法在提高外源蛋白可溶性的同時往往還能提高融合蛋白在大腸桿菌中的表達量。但是融合蛋白通常需要表達后再酶切才能釋放出有活性的蛋白。而酶切的步驟增加了純化工藝和成本，酶消化過程則增加了蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性。因此本發(fā)明提出的基因工程表達的犬干擾素α不需要酶切將極大地節(jié)約生產(chǎn)的成本。另外，現(xiàn)在市場上的干擾素制劑需要每天給藥，2-4周為一個療程。每天給藥和長時間的周期不僅是病犬的痛苦，也增加了飼養(yǎng)主的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。本發(fā)明通過基因工程將犬干擾素α與大腸桿菌蛋白NusA蛋白融合表達，NusA蛋白分子量大，能夠保護分子量較小的犬干擾素α，形成空間位阻，阻止蛋白酶對犬干擾素α的降解，使犬干擾素α穩(wěn)定性提高，能長時間保留活性，本發(fā)明對犬干擾素α穩(wěn)定性的提高有效地改善了上述現(xiàn)狀。

發(fā)明內(nèi)容

現(xiàn)有技術(shù)中的犬干擾素α在大腸桿菌表達系統(tǒng)中多為包涵體。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)制備犬干擾素α產(chǎn)物為包涵體的缺陷，提出了一種可溶的犬干擾素α融合蛋白及其核酸序列。針對現(xiàn)有技術(shù)中的犬干擾素α多為包涵體、表達量低、融合蛋白雖能解決上述缺陷但往往需要表達后再酶切才能釋放出有活性的犬干擾素α的問題，本發(fā)明提出了一種犬干擾素α融合蛋白，不但不用酶切就有活性，且穩(wěn)定性提高。

本發(fā)明提出一種編碼犬干擾素α融合蛋白的核酸序列，所述犬干擾素α融合蛋白具有如SEQ?ID?No：1所示的核酸序列。