[發(fā)明專利]一種利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410560288.8
• 申請(qǐng)日: 2014-10-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104388420A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁銳;張立軍;陳旭輝;崔振海;敖永華;于金龍;馬蓉;曹松屹;秦萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 沈陽(yáng)科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，可用于提高體外獲得質(zhì)粒DNA的效率以及增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

質(zhì)粒是一種能夠獨(dú)立于染色體進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳單位，絕大部分質(zhì)粒都是環(huán)形雙鏈DNA。從上世紀(jì)70年代開(kāi)始，研究者開(kāi)始在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出大量具有不同功能及特性的專用質(zhì)粒載體。目前，這些人工構(gòu)建的質(zhì)粒已經(jīng)成為基因工程中最常用、最核心也是最有效的工具之一。

有報(bào)道稱，僅2013年，以質(zhì)粒為核心的基因免疫及治療市場(chǎng)產(chǎn)值接近450億美元，并且這一市場(chǎng)還呈現(xiàn)不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，相應(yīng)對(duì)質(zhì)粒DNA的需求也不斷加大。

通常情況下，大量獲得某一質(zhì)粒主要依賴于將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌（一般為大腸桿菌），并使其大量繁殖，對(duì)菌體進(jìn)行裂解以釋放質(zhì)粒并對(duì)其收集純化。具體步驟包括：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，菌體培養(yǎng)，質(zhì)粒提取純化等步驟。整個(gè)過(guò)程需要2-3天，周期較長(zhǎng)。如果目標(biāo)質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒，提高質(zhì)粒產(chǎn)量往往需要通過(guò)擴(kuò)大菌體培養(yǎng)規(guī)模，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，相應(yīng)的成本也將增加。

質(zhì)粒DNA導(dǎo)入宿主菌后，其復(fù)制會(huì)對(duì)宿主菌造成負(fù)擔(dān)。質(zhì)粒上某些基因的表達(dá)還可能對(duì)宿主菌具有毒害作用，這些情況都對(duì)于高效獲得大量質(zhì)粒DNA都會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。

為了縮短周期，降低成本，勢(shì)必要尋求一種不依賴于宿主菌的獲得大量質(zhì)粒的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，具有高效快速，節(jié)省成本，應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足，為快速獲得大量質(zhì)粒DNA提供新的途徑。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA，包括以下步驟：

1、根據(jù)需要獲得的模板質(zhì)粒DNA序列信息設(shè)計(jì)引物（上游引物，下游引物），上下游引物分別與質(zhì)粒DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)并且兩條引物的5’端20個(gè)堿基互補(bǔ)；

2、利用步驟（1）中設(shè)計(jì)的引物對(duì)0.5?μg模板質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3、對(duì)步驟2中獲得的產(chǎn)物取2?μL進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)產(chǎn)物濃度，并將剩余部分于-20?°C保存?zhèn)溆茫?/p>

上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)步驟包括：

（1）PCR反應(yīng)體系（50?μL）：5?×?TransStart?FastPfu?buffer?10?μL，dNTPs（2.5?mM?each）?5?μL，上游引物（10?mM）2?μL，下游引物（10?mM）2?μL，模板質(zhì)粒DNA?0.5?μg，TransEco?FastPfu?DNA?Polymerase?1?μL，滅菌水補(bǔ)足至50?μL。

（2）PCR反應(yīng)程序：95?°C?2?min；95?°C?20?s，50?°C?40?s，72?°C?1?min，共25循環(huán)；72?°C?5?min。

（3）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：稱取0.4?g?瓊脂糖粉末，加入40?mL?0.5×TBE緩沖液中，微波加熱至瓊脂糖完全溶解后加入2?μL?DNA染色液EB，混合均勻，趁熱倒入制膠槽中，并插上梳板，室溫靜置20?min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，將制備好的瓊脂糖凝膠放入盛有0.5×TBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應(yīng)沒(méi)過(guò)膠面，吸取2?μL與上樣緩沖液混勻的PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔，在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA?marker），接通電源在5?V/cm?條件下電泳30?min，電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，輕輕地置于紫外透射儀上成像，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA?marker）判斷擴(kuò)增條帶的濃度及大小，將剩余PCR產(chǎn)物于-20?°C保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明涉及的技術(shù)通過(guò)對(duì)少量模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可快速獲得大量質(zhì)粒DNA，與傳統(tǒng)方法相比具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：

（1）周期短：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增質(zhì)粒，只需要幾個(gè)小時(shí)即可獲得大量可直接用于后續(xù)操作的質(zhì)粒DNA，與傳統(tǒng)方法2-3天的周期相比，大大縮短了質(zhì)粒獲取的周期。

（2）操作簡(jiǎn)便：進(jìn)行一次PCR反應(yīng)即可獲得大量質(zhì)粒，省去了傳統(tǒng)方法質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等大量工作，簡(jiǎn)化了操作流程。

（3）成本低廉：由于跳過(guò)了培養(yǎng)細(xì)菌的相關(guān)過(guò)程，節(jié)約了該過(guò)程中的藥品、儀器、人工等方面的消耗，節(jié)約了成本。

（4）應(yīng)用范圍廣泛：利用本發(fā)明涉及的技術(shù)獲取質(zhì)粒DNA，無(wú)需宿主菌參與，對(duì)于依賴特殊宿主菌才可以進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒同樣適用。