[發明專利]一種利用PCR技術快速獲得大量質粒DNA的方法

在審

• 申請號: 201410560288.8
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN104388420A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 丁銳;張立軍;陳旭輝;崔振海;敖永華;于金龍;馬蓉;曹松屹;秦萍
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 張述學

1.?一種利用PCR技術快速獲得大量質粒DNA的方法，其特征在于：

（1）、根據需要獲得的模板質粒DNA序列信息設計引物（上游引物，下游引物），上下游引物分別與質粒DNA的兩條模板鏈互補并且兩條引物的5’端20個堿基互補；

（2）、利用步驟（1）中設計的引物對0.5?μg模板質粒進行PCR擴增；

（3）、對步驟（2）中獲得的產物取2?μL進行瓊脂糖電泳，檢測產物濃度及條帶大小，并將剩余部分于-20?°C保存備用。

2.根據權利要求1所述利用PCR技術快速獲得大量質粒DNA的方法，其特征在于?PCR擴增反應及瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟，包括：

（1）PCR反應體系（50?μL）：5×TransStart?FastPfu?buffer?10?μL，dNTPs（2.5?mM?each）?5?μL，上游引物（10?mM）2?μL，下游引物（10?mM）2?μL，模板質粒DNA?0.5?μg，TransEco?FastPfu?DNA?Polymerase?1?μL，滅菌水補足至50?μL；

（2）PCR反應程序：95?°C?2?min；95?°C?20?s，50?°C?40?s，72?°C?1?min，共25循環；72?°C?5?min；

（3）瓊脂糖凝膠電泳檢測：稱取0.4?g?瓊脂糖粉末，加入40?mL?0.5×TBE緩沖液中，微波加熱至瓊脂糖完全溶解后加入2?μL?DNA染色液EB，混合均勻，趁熱倒入制膠槽中，并插上梳板，室溫靜置20?min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，將制備好的瓊脂糖凝膠放入盛有0.5×TBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應沒過膠面，吸取2?μL與上樣緩沖液混勻的PCR產物加入瓊脂糖凝膠的點樣孔，在其中一個點樣孔中加入DNA分子量標準（DNA?marker），接通電源在5?V/cm?條件下電泳30?min，電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，輕輕地置于紫外透射儀上成像，根據DNA分子量標準（DNA?marker）判斷擴增條帶的濃度及大小，將剩余PCR產物于-20?°C保存備用。